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大豆低聚糖中棉籽糖的测定 低聚糖大豆的主要成分有水苏糖、棉籽糖（也称为三糖）和葡萄糖，以及少量的毛尖糖。因为人体肠道内缺乏半乳糖苷酶,所以人体不能直接利用大豆低聚糖,但它可以被肠道内的双歧杆菌充分利用,双歧杆菌能产生短链脂肪酸和一些抗菌物质,从而可抑制外源致病菌和肠道内的腐败菌的生长繁殖。大豆低聚糖还具有热能低和防龋齿的作用。 低聚糖的测定方法有很多种,主要有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。由于糖在受热时没有足够的挥发性,在用GC法测定时要预先将其制备成易挥发、对热稳定的衍生物。HPLC法(包括HPLC-RID和HPLC-ELSD)虽然具有可定性和定量的优点,但是色谱柱和试剂费用高,在工业化生产过程中小企业质量检测与控制不太适用。所以建立一种简单方便、快速经济的检测方法势在必行。 目前,国内对薄层-比色法测定棉籽糖含量研究较少,罗宁刚等建立的方法中所用展开剂为异丙醇-乙酸-水,展开时间为2.4h。本实验以大豆低聚糖中棉籽糖的含量测定为例,研究薄层色谱-苯酚-硫酸法测定大豆低聚糖中棉籽糖含量,为快速经济的测定大豆低聚糖中棉籽糖提供技术手段。 1 材料和方法 1.1 有限的分析纯 大豆低聚糖 南通四海植物精华有限公司;棉籽糖标准品 开鲁县昶辉生物技术有限责任公司;硅胶G板(254) 青岛海洋化工有限公司;苯胺、二苯胺、85%磷酸、苯酚、9 8%浓硫酸、正丁醇、正丙醇、丙酮、冰乙酸皆为分析纯;乙腈(色谱纯) 美国Tedia公司;本实验所用蒸馏水均为二次蒸馏水。 1.2 光谱仪器和光谱 UV2450紫外可见分光光度计 日本岛津公司;SP-722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;1200高效液相色谱仪(配有美国Softa Model 300s ELSD检测器) 美国Agilent公司。 1.3 方法 1.3.1 准备工作 1.3.1. 丙酮溶液配制 显色剂的配制:4g二苯胺,4mL苯胺及85%磷酸20mL溶于200mL丙酮液中。 苯酚溶液的配制:准确称取经过重蒸馏之后的苯酚5g,加水定容至100mL,配制成5g/100mL的苯酚溶液备用。 1.3.1. 2.橡胶板的激活 将硅胶板置于110℃烘箱中活化1h后,置于干燥器中备用。 1.3.2 试剂的确定 根据展开剂选择的原则,选出几种展开剂进行实验,直至选出能分离大豆低聚糖的展开剂。 1.3.3 层析压织物显色剂的制备 用微量进样器取5μL大豆低聚糖溶液样品在110℃活化1h后的薄层板上点样。点样采用条带点样,条带的长度为3cm。将点样好的薄层板置于层析缸中,无风,25℃恒温条件下展开后取出,晾干。利用电动喷雾装置均匀喷上显色剂,于85℃显色15min,自然冷却。在显色后薄层板上棉籽糖的条带区域取1.5cm×4.0cm的条带面积,收集在离心管中,加3m L水摇匀,超声20min后取出,4500r/min离心20min,取上清液备用。 1.3.4 样品测定 1.3.4. 苯酚溶液的吸收剂用量 取2mL上述上清液于具塞试管中,加入1mL 5g/100mL的苯酚溶液,摇匀,迅速加入5mL浓H2SO4,摇匀,沸水浴加热3min后,取出,冷却至室温,在最大吸收波长处测定吸光度。 1.3.4. 棉籽糖标准曲线的绘制 将预先配制好的梯度质量浓度为20、30、40、50、60、70、80mg/mL的棉籽糖标准液通过薄层层析-苯酚-硫酸法在波长490nm处测量其吸光度,根据吸光度制作棉籽糖标准曲线。 1.3.4. 流动相、柱温度 HPLC色谱条件:色谱柱:Kromasil氨基柱(250mm×4.6mm,5mm);流动相:V(乙腈):V(水)=75:25;流速:1mL/min;柱温:30℃;漂移管温度:70℃;检测器:蒸发光散射检测器。 2 结果与分析 2.1 大豆低聚糖中蔗糖、棉籽糖和水苏糖的合成 比较各种展开剂的展开效果(表1),发现以V(乙腈):V(冰乙酸):V(水)=6:3:2的展开效果最好,能分开大豆低聚糖中蔗糖、棉籽糖和水苏糖。以V(乙腈):V(冰乙酸):V(水)=6:3:2为展开剂展开效果见图1。 2.2 标准棉糖曲线的确定 2.2.1 彩色法最大吸收波长的确定 由图2可见,苯酚-硫酸法测定棉籽糖含量的最大吸收波长为490nm。 2.2.2 棉籽糖标准曲线的建立 通过薄层层析-苯酚-硫酸法测得的吸光度与棉籽糖质量浓度的标准曲线见图3,回归方程为y=0.0119x-0.0658,相关系数为R2=0.9932。 2.2.3 稳定实验 棉籽糖标准样品比色液在不同时间进行测定所得的吸光度如表2所示,可以看出样品的吸光度RSD为1.12%,表明比色液在3h内比较稳定。 2.2.4 重复使用 配5份同一浓度的样品,分别用薄层层析-苯酚-硫酸法测定其吸光度,根据计算得RSD