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中药化学成分快速液相色谱技术研究进展 中医学历史悠久，悠久。中药不仅是我国医药体系中独具特色的重要组成部分,也是西方医药,特别是植物药、天然药物的有机组成部分。众所周知,中药防治疾病的物质载体是其所含有的化学成分群。因此,中药化学成分分析一直是其药效物质阐明及质量控制的关键。但由于中药化学成分的复杂性,中药成分分析存在诸如分离难度大、分析时间长等问题。近年来,快速高效液相色谱分离技术的发展与成熟有效地弥补了传统的高效液相色谱(HPLC)分析中存在的不足,使中药化学成分分析进入了高效、高通量的阶段。该技术的主要特色是通过优化色谱分离参数,增加色谱分离柱效,同时使分析时间大为缩短。这些色谱参数在分离中的作用可由简化后的液相色谱速率理论方程式解释: H=A+Cu≈2λdp+f(k)d2puDm(1)Η=A+Cu≈2λdp+f(k)dp2uDm(1) 式中:H为理论塔板高度,A和C分别为涡流扩散系数和传质阻力系数,u为线速度,λ为填充不规则因子,dp为填料(固定相)颗粒的平均直径,k为保留因子,Dm为分析物在流动相中的扩散系数。由式(1)可知,流动相的流速及固定相的粒径是影响理论塔板高度(即柱效)的两大因素。该方程中虽无温度参数,但温度影响扩散系数Dm,进而影响传质阻力项,所以温度也是影响色谱分离柱效的一个重要因素。 目前,针对上述可优化的色谱参数发展起来的快速高效液相色谱分离技术主要包括超高压液相色谱、基于整体柱的高效液相色谱及高温液相色谱等。其中,在中药分析领域,以超高压液相色谱方法的应用最为广泛。 1 亚2m多孔微球填料 由式(1)可知,固定相的粒径越小,理论塔板高度越小,柱效越高,因此固定相的粒度控制着分离的质量。每种固定相的粒径尺寸都有对应最佳柱效的流速,而更小的固定相粒度使最高柱效点向更高的流速(线速度)方向移动,而且有更宽的最佳线速度范围。当固定相的粒径为亚2 μm填料时,板高-流速(H-u)曲线几乎成一条平行于横轴的直线,表明流速与板高几乎无关。针对固定相粒径这一影响柱效的重要因素,超高压液相色谱技术使用了亚2 μm填料。由于这种填料的色谱柱孔隙率低,渗透性下降,在相同流速下产生的压力增大,因此产生了超高压液相色谱。与常规HPLC相比,超高压液相色谱可获得更高的柱效,亚2 μm粒径填料提供的柱效比5 μm粒径填料提高3倍。同时因为分离度与填料粒径的平方根成反比,因此采用亚2 μm粒径填料得到的分离度比5 μm粒径填料提高70%,所以与常规的HPLC相比,超高压液相色谱的分离度大大提高。使用亚2 μm粒径填料的色谱柱,其柱长为5 μm粒径时的1/3,而保持柱效不变;同时可将流速提高3倍进行分离,使分离过程加快而分离度保持不变。另外,填料颗粒的比表面积决定了色谱分离的峰容量。超高压液相色谱使用亚2 μm多孔微球填料,比表面积增大,从而使峰容量增大,分离能力提高,可分辨出更多的色谱峰,提供的样品信息量达到了一个新的水平,且在兼顾柱效的同时,最大限度地缩短了分析复杂样品所需的时间。同时,由于亚2 μm粒径填料的色谱柱柱效较高,使得色谱峰宽变窄,峰高增加,灵敏度提高。因此,使用超高压液相色谱技术不仅可以在保持与常规HPLC相同分离度的同时增加峰高,在改善分离度的同时亦可增加峰高(即提高灵敏度)。目前,商品化的超高压液相色谱仪主要包括超高效液相色谱仪(ultra performance liquid chromatography,UPLC,Waters公司)、高分离快速液相色谱仪(rapid resolution liquid chromatography,RRLC,Agilent公司)。UPLC采用1.7 μm粒径的颗粒填料,获得了更高的柱效与更快的分离速度。性能优越的色谱柱,精确梯度控制的超高压液相色谱泵,低扩散、低交叉污染的自动进样系统及高速检测器,使UPLC的峰容量、分析效率、灵敏度较常规的HPLC有了很大的提高,为中药复杂体系的分离分析提供了良好的平台。基于同样的原理,Agilent公司随之推出了RRLC,该公司生产的1.8 μm粒径的颗粒填料的色谱柱除了耐高压外,在耐高温方面也同时得到了改进。 超高压液相色谱现已广泛运用于中药成分分析、中药指纹图谱、中药及其复方制剂的定性和定量等方面。本实验室使用RRLC技术,采用二极管阵列检测器(DAD)及飞行时间质谱(TOF MS)作为检测器对14个不同来源的黄芪(Radix Astragali)商品药材进行定性、定量分析。对黄芪13个对照品的混合溶液及药材提取液分析时发现,与传统HPLC(色谱柱为250 mm×4.6 mm,5.0 μm)相比,使用RRLC(色谱柱为50 mm×4.6 mm,1.8 μm)可大大提高分析速度,分析时间由原来的70 min缩短为现在的18 min,