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日本血吸虫中国大陆株26kda抗原的细胞表位 作为综合预防和控制的措施之一，世界卫生组织将刑事法规的发展战略列入其制定的优先顺序。目前国内外实验室克隆和表达的血吸虫病疫苗候选分子,其保护力尚不够理想。将不同抗原分子的多种表位组合在一起,构建“鸡尾酒”型复合多价疫苗或许能够提高其保护力。获得有效的抗原表位是复合多价疫苗研制的物质基础。本研究采用计算机软件预测抗原表位并重组入表达载体pET-32c(+)进行原核表达,用重组表位肽进行淋巴细胞增殖实验,初步鉴定了日本血吸虫中国大陆株22.6 kDa抗原(Sj22.6)的3个T细胞表位。 材料和方法 1 t细胞表位预测 根据张桂筠等报道的Sj22.6氨基酸序列,分别用GUATIF、TEPITOPE、ANTHIWHIN软件预测其T细胞表位。选取3种软件预测结果一致的候选表位肽。 2 表内醇脂肪酸的合成 2.1 -内酰胺酶切位点分子p的体外分离和鉴定 根据表位肽氨基酸序列及Sj22.6相应的核苷酸序列设计表位肽核苷酸正、负链。设计时在其上游和下游各加入NcoⅠ及XhoⅠ酶切位点。用来源于日本血吸虫线粒体相关蛋白(Sj338)的肽段P1作为无关表位肽(氨基酸序列为:LDEVVNHFAIAVSIC,早期实验证实不能刺激淋巴细胞增殖,未发表资料)。核苷酸序列由上海生物工程公司合成。核苷酸序列设计结果如下: 2.2 磷酸序列的冷却 取相配对的正负两条寡核苷酸链各80 pmol,在终体积80 μl退火缓冲液中混匀,置90℃水浴5 min,缓慢冷却至室温。 2.3 阳性菌落的筛选 取pET-32c(+)质粒,同时用NcoⅠ及XhoⅠ(Roche公司)双酶切。酶切产物切带纯化后与上述退火产物按1∶5摩尔比在T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)作用下16℃连接过夜。连接产物转化入大肠杆菌BL21感受态细胞,Amp选择培养基筛选出阳性菌落。碱裂解法提取质粒,经酶切及序列测定鉴定阳性克隆。 3 核心产物的提取 将含有目的基因的重组转化子细菌接种到LB培养基中,37℃振荡培养过夜,次日以1∶50转种到新鲜的含Amp LB液体培养基中,继续培养至OD600=0.4～0.6,分别加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L(P6)、1.0 mmol/L(P1、P2、 P3、P4、P5),继续培养2 h(P6)、3 h(P1、P2、 P3、P4、P5)离心收集沉淀。将表达产物用PBS悬浮,反复冻融后12 000 g离心10 min收集上清。按NTA柱(SNBC 3S NTA Resin,上海申能博彩公司)说明书,将样品过柱,用NTA-0 Buffer充分洗涤,以去除未结合的蛋白质。目的蛋白用含不同浓度咪唑的NTA Buffer分步洗脱,洗脱液在12% SDS上电泳观察融合蛋白的分布并在PBS中透析。 4 淋巴结移植试验 4.1 实验动物 C3H/HeJ小鼠(H-2k),雌性,6～8 wk,购自中国科学院上海实验动物中心。 4.2 rj22。6蛋白的制备 方法见文献。 4.3 动物免疫法 取阳性钉螺(江苏省寄生虫病研究所提供),常规法逸出尾蚴,集于盖玻片上,置紫外灯(Konrad Benda,6908型)下400 μW/cm2照射60 s后用于动物免疫。 4.4 紫外线致弱尾 5只C3H/HeJ小鼠,经腹部皮肤每鼠接种400±50条紫外线致弱尾蚴。于接种后5 wk每鼠经尾基部皮下注射rSj22.6 20 μg(与不完全福氏佐剂1∶1乳化)加强免疫。 4.5 正离子型谷氨酰胺hepes 实验鼠于加强免疫后7～10 d,无菌取脾分离脾细胞,以含10%胎牛血清的完全RPMI 1640培养液(Gibco公司,含2 mmol/L L-谷氨酰胺,10 mmol/L HEPES,50 μmol/Lβ-巯基乙醇,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素)调整细胞浓度至2.5×106/ml,于96孔平底培养板(NUNC公司)中加上述脾细胞悬液200 μl/孔。每孔加终浓度为10 μg/ml重组表位肽融合蛋白,对照孔不加刺激物,每组均设3个复孔,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h,培养结束前6～16 h加3H-TdR 0.5 μCi/孔。 4.63 cpm值的测定 用多头细胞样品收集器收集细胞至玻璃纤维滤膜,置红外线快速干燥器干燥后加入闪烁液,用液闪计数仪测定cpm值(每分闪烁次数)。计算刺激指数(SI)=(实验组cpm值-机器本底cpm值)/(阴性对照cpm值-机器本底cpm值),SI值2.0认为阳性。 结果 1 表位肽的筛选 从3种软件预测结果中筛选出日本血吸虫中国大陆株22.6 kDa抗原(Sj22.6)的4个候选表位肽,分别命名为P3、P4、P5、P6,相应的氨基酸序列分别为:P3:TTEYRLSLMEQFIR