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hlcs和rassf1a在无创产前诊断中的应用 在孕妇血浆中存在游离状态的胎儿氮基因可用作无创伤性产前诊断胎儿遗传物质来源。要将胎儿DNA从大量的母源性DNA背景中分离出来,必须采用高效、特异的胎源性DNA标志物。近年来随着表观遗传学的发展,人们发现母体和胎儿之间的某些位点存在甲基化程度的差异,一方呈高甲基化,而另一方呈低甲基化。这种母胎差异性甲基化位点,独立于性别特异性基因及多态性遗传位点,有望成为孕妇血浆中胎儿DNA识别的新型标志系统。本研究基于武汉地区388例妊娠妇女,对HLCS、RASSF1A片段在母胎间甲基化程度的差异以及在无创性产前诊断中的价值进行了探索。 对象和方法 1. 妊娠合并周各不同岁阶段 收集2008年3月至2011年3月在武汉大学中南医院妇产科就诊的正常单胎孕妇共384例,平均年龄为27.63±2.62岁(20～40岁),孕7～42周,其中早孕133例、中孕121例、晚孕130例。孕妇均无各种妊娠合并症和并发症。另有4例21三体综合征妊娠。在任何创伤性操作或分娩前抽取孕妇外周血5-10ml,EDTA抗凝。同时对其中126例孕妇同时收集其人工流产绒毛组织或引产、分娩时胎盘组织,-80℃保存。 2. 方法 (1) 离心组织研成匀浆 外周血标本1600g离心10min,分别吸取血浆及血细胞置入不同离心管,血浆标本16000g离心后收集上清,血细胞2500g离心后收集沉淀。绒毛或胎盘组织研成匀浆。按照说明书分别进行血浆(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, Qiagen, Germany)、血细胞(QIAamp DNA Blood Kit,Qiagen, Germany)、组织(QIAamp DNA Mini Kit,Qiagen, Germany)的DNA提取,-80℃保存。 (2) 甲基化cda的合成 以甲基化敏感性限制性内切酶BstUI (New England Biolabs, Inc., USA)对样本DNA进行消化,该酶可以选择性切断未甲基化的cgcg而对甲基化位点无损伤。反应体系及条件如下:反应总体积为50μl,内含1 x buffer和50U MSRE,另外加入绒毛、胎盘或血细胞基因组DNA模板200ng,或5ml血浆中提取的DNA;60 ue84aSymbolpB@C孵育至少16h,同时以不含MSRE的反应体系作为空白对照。按照Chan的方法,以消化前、后DNA为模板,对已知未甲基化且含有BstUI酶切位点的ACTB基因片段进行扩增,评估消化是否完全。 (3) 荧光信号分析 以消化前、后的各DNA样本作为模板,进行HLCS、RASSF1A基因的荧光定量PCR扩增。反应总体系为25μl,内含12.5mL 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen, Hilden, Germany),2.5μl模板DNA,1μl上下游引物(终浓度300 nM)(赛百盛生物技术公司,北京)。95 ue84aSymbolpB@C预变性15min后,95℃变性15s,60℃退火1min,72ue84aSymbolpB@C延伸45s,共50个循环,最后72ue84aSymbolpB@C再延伸10min。每个样品设3复孔,样品浓度取其平均值。每个反应均以PBS代替模板作为空白对照。利用 SDS v1.3.0 软件 (Applied Biosystems) 进行荧光信号的采集及分析。引物序列见表1,HLCS、RASSF1A扩增产物均含有cgcg位点。 (4) 不同组织中甲基化程度比较 按照以下公式计算甲基化指数(Methylation Index, MI),反映各位点在不同组织中的甲基化程度:MI=消化后基因拷贝数/消化前基因总拷贝数。 (5) 实际子宫测试类型的评估 通过绒毛或脐血细胞培养及染色体分析确定胎儿核型。 (6) 样本均数对因子认识的影响 正态性及方差齐性分析示本研究计量资料满足参数检验的前提条件,因此采用配对t检验、多元回归分析探究样本均数之间的差异及影响因素。以P0.05认为有统计学差异,P0.01有极显著差异。 结果 1. hlcs及rassf1a在血清中的表达 分别以MSRE消化前后的胎盘(或绒毛)、外周血DNA为模板,进行HLCS、RASSF1A的扩增。同时扩增ACTB基因,结果示消化前DNA均可检出ACTB片段,而消化后DNA均不能检出,说明消化反应完全。此外,HLCS、RASSF1A在胎盘或绒毛中均呈高甲基化状态,而在母血细胞中呈低甲基化状态,见图1。126例胎盘或绒毛及外周血细胞中HLCS、RASSF1A位点的MI值见表2。配对t检验示在妊娠不同时期,HLCS、RASSF1A位点在两种组织中的MI值均存在极显著差