DB51T 2521-2018蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程.docxVIP

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2521—2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 2018 - 07 - 23 发布 2018 - 08 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 I DB51/T 2521—2018 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 试剂和材料 1 5 设备和器械 2 6 临床检查 2 7 实验室样品采集 2 8 细菌分离与纯化 2 9 细菌鉴定 2 10 结果判定 4 11 综合判定 5 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方 6 附录 B（资料性附录） 脑膜炎败血伊丽莎白菌 16S rRNA 基因参考序列（1450bp） 9 II DB51/T 2521—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、陈德芳、郑李平、黄小丽、欧阳萍、白明焕、王世震。 1 DB51/T 2521—2018 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、 实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于牛蛙(Rana catesdeiana)、美国青蛙(Rana grylio)、虎纹蛙(Ranatigrinarugulosa)、 黑斑蛙(Rana gotiath)、棘胸蛙(Rana spinosa)、林蛙(Rana sylvatica)等蛙类脑膜炎败血伊丽莎白菌 病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌病 是指由脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)感染引起的蛙类发病或死亡的 一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.3 16S rRNA 16S ribosomal RNA 基因 16S核糖体RNA基因。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 2 DB51/T 2521—2018 按GB/T 4789.28、GB/T 18652与SC/T 7014规定执行。Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+ ）、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂， 上述未提及的见附录 A。 4.2 水 应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 4.3 引物 16S rRNA基因DNA序列扩增引物，F： 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ ，R：5 ′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC-3′ ，-20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病蛙体色发黑，厌食懒动，运动机能失调，头部歪斜，游动失去平衡或浮于水面间隙性旋转。 6.2 外部检查 病蛙眼角膜发白， 呈“白内障”表现， 肛门红肿； 四肢肿胀， 后肢内侧充血、出血发红， 腹部膨胀； 部分病蛙体表出现溃疡。 6.3 剖检 腹腔内大量淡黄色腹水， 肝、脾、肾肿大， 淤血、出血， 胆囊扩张， 胆汁充盈； 肠道充血， 肠腔无 食物，其内充滞多少不等的黏液。 7 实验室样品采集 样品采集按SC/T 7103 规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中， 从病蛙的肝、肾中直接