双苯甲亚胺与脱氧核糖核酸的相互作用.docxVIP

双苯甲亚胺与脱氧核糖核酸的相互作用 具有特定官能的有机小分子与生物大分子之间的相互作用对研究生物大分子的结构和功能、理解和模拟生物物理过程非常重要。在分析氨基酸和有机小分子的关系时，考虑到酸和有机小分子之间的结合反应，我们可以根据氨基酸和一些有机的小分子的作用来确定化合物。另一方面，在测定某些有机质分子的作用后，还原到某些有机质分子的能量转移来进行定量和测定。这些有机小分子主要由溴乙烯和二聚体、双苯甲胺（hoechst33258）和吡啶引起。 Hoechst33258(H33258)是双苯并咪唑类物质的一种衍生物(结构见图1), 是一种多环芳香族小分子物质, 具有一定的电化学性, 能够特异性的与DNA相互作用, 可作为DNA的电化学杂交指示剂. Hoechst 33258溶液自身的荧光很微弱, 它与DNA作用后, 使其荧光强度得到极大增强, 何品刚等利用Hoechst33258与DNA作用的荧光特性对其作用机理进行了详细的研究, 证实了两者即有嵌入作用也有非特异的静电作用, 主要作用在A-T碱基区域, 并且磷酸根可以减弱二者的非特异性静电作用. 孙逊等人利用Hoechst33258与DNA结合后荧光增强的特点测定基因治疗非病毒载体中DNA的含量, 所建立的荧光分光光度法为载基因纳米粒、 脂质体制备工艺和质量标准的建立提供了依据. 但他们也发现DNA与荧光染料结合后发射的荧光随着时间的延长会有一定程度的衰减, 所以其溶液必须在配置好后立刻检测. 本文运用共振光散射法(RLS), 结合吸收光谱对Hoechst33258与核酸的结合方式进行了研究. 实验表明, 单链DNA与Hoechst33258作用时其散射比双链作用时强, 证明Hoechst33258与DNA的作用除了相互嵌入外还有静电作用. 实验发现, Hoechst33258与核酸作用后产生增强的RLS信号, 其增强的RLS强度与一定范围内的DNA浓度成正比. 且时间对RLS测定的影响很小. 三维光谱说明该体系的荧光对散射测定不产生干扰. 1 实验部分 1.1 水n,b浓度测定 F-2500荧光分光光度计(日立公司); F-4500荧光分光光度计(日立公司); UV-3010紫外可见分光光度计(日立公司); 旋涡混合器(海门市其林贝儿仪器制造有限公司); 酸度计PHS-3C(上海大中分析仪器厂). DNA储备溶液: 将鱼精DNA(fsDNA, 上海生物化学研究所)直接溶于适量水中配成, 并保存于0～4 ℃冰箱中, 操作液浓度为50.0 mg/L; Hoechst33258: 准确称取0.0125 gHoechst33258(Fluka AG), 溶于50 ℃热水, 用二次水稀释到250 mL, 浓度为1.0×10-4mol/L; 使用Britton-Robinson缓冲溶液控制溶液的酸度. 其他试剂均为分析纯. 1.2 实验步骤 1.2.1 荧光分光光度计的确定 向10.0 mL比色管中加入一定体积的fsDNA 和1.0 mL的BR(pH=7.66)缓冲溶液, 漩涡混合后再加入适量的1.0×10-5mol/L的Hoechst33258. 最后用二次水稀释至刻度, 混匀后于荧光光度计上在λem=λex的条件下进行同步扫描获得RLS光谱, 扫描范围在220～700 nm, 在385.0 nm处测定RLS强度, 荧光分光光度计的激发和发射狭缝始终保持在5.0 nm. 三维光谱是在F-4500荧光分光光度计上获得. 1.2.2 变性dna片段的制备 将鱼精DNA(dsDNA)在沸水中煮沸15 min, 然后在冰水混合物中迅速冷却, 15 min后, 经过变性处理后鱼精DNA片段被打开为单链的变性DNA(ssDNA)片段. 2 结果与讨论 2.1 单链dna与hoechst33258作用的热重检测 图2为Hoechst33258(a)及其与DNA作用后(b)的三维光谱图, 从图中可以看出, 在λex=λem直线上的292 nm和385 nm处有2个特征散射峰(即A和B), 此外, 还存在C(λex= 325.0 nm,λem= 465.0 nm)和D(λex=240.0 nm,λem=480.0 nm)2个峰, 其中C为荧光发射峰, D为半频峰. 加入DNA后其荧光(C1)和散射(A1, B1)强度都增强, 但散射增强程度明显高于荧光增强程度; 图中还说明荧光信号与散射信号没有发生重叠, 据此, 可以建立灵敏的DNA共振光散射测定法. 图3是fsDNA与H33258作用的共振光散射光谱图. 从图3的fsDNA与Hoechst33258作用的光散射光谱图可以看出, 单独的fsDNA溶液或Hoechst33258溶液在测定条件下的RLS信号十分微弱, 但当Hoechst33258与fsD