第四章目的基因的转化及其原理.pptVIP

1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，基因工程中难以操作； ②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，..难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因； ③T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； ④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体； ⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 * 本文档共52页；当前第30页；编辑于星期三\15点12分 为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（in