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gjb6基因外显子区在1例外胚叶发育不良患者中的应用 出汗性外生殖生殖生殖不足（mid，mim12950）是一种以甲基、毛发和掌叶（或牙齿）为特征的正常染色体遗传疾病，主要以家庭发育不良为特征。1929年, Clouston报告了一个法籍加拿大家系患有该病后, 引起了人们的重视, 后又称其为Clouston综合征。该病典型的临床表现有指 (趾) 甲营养不良、部分或完全脱发、掌跖部皮肤角化过度、牙齿发育不全, 部分患者可出现白内障、斜视、骨骼改变、听力减退、指 (跖) 畸形, 少数有癫痫发作、智力障碍、神经性耳聋等。汗腺和皮脂腺功能通常正常。由于受遗传和环境等多方面因素影响, 这些症状不一定同时存在, 有的仅有其中1~2种表现, 导致临床上有时难以明确诊断。目前研究已证实GJB6基因为该综合征的致病基因。我们采用聚合酶链反应和DNA直接测序法, 对1例可疑HED的患者进行了基因突变检测, 为产前诊断和遗传咨询提供依据。 1 对象和方法 1.1 病例对照表现 患者, 男, 13岁, 2008年就诊于安徽医科大学第一附属医院, 其母亲诉患者出生后即发现眉毛和头发缺失。后眉毛和头发部分长出, 呈稀疏、黄、软, 但仍呈部分缺失, 且甲渐增厚。患者父母亲、妹妹和其他家族成员均无类似表现。患者父母非近亲结婚。体检:一般情况, 发育及智力正常, 口腔粘膜及牙齿正常, 部分眉毛、后枕部头发缺如, 指 (趾) 甲远端1/3稍增厚 (见图1) ;汗腺和皮脂腺分泌正常, 掌跖部未见明显异常。甲屑真菌镜检及培养均为阴性。患者初诊为“先天性厚甲症”, 经筛查先天性厚甲症的K6a、K6b、K16和K17基因无异常突变后, 排除了先天性厚甲症。后经国际厚甲组织成员Frances博士等专家义诊, 认为该患者为HED, 需进行GJB6基因检测。 1.2 方法 1.2.1 基因组dna的提取 在取得患者及家属的知情同意后, 抽取患者及家庭中正常人的静脉血2m L置于EDTA抗凝管中。采用基因组DNA快速抽提纯化试剂盒 (上海生工生物工程技术有限公司) 提取基因组DNA, 同时提取100例健康对照者 (均为门诊随机挑选的非外胚叶发育不良无血缘关系的患者) DNA。部分患者的DNA带到英国Ninewells医学院分子和细胞病理学系实验室由Frances博士检测。 1.2.2 ctttctc-3 根据文献合成引物的序列:正向:5’-GGACGCTGCACACTTTCATC-3’;反向:5’-GCTTGGGAAACCTGTGATTG-3’, 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成, 引物采用PAGE纯化后稀释为20μmo L/L备用。 1.2.3 pcr产物的变化 扩增条件:94℃预变性5min后, 94℃变性45S, 56~64℃复性45S, 72℃延伸45S, 共30个循环, 72℃后延伸10min, 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 采用Exonl和SAP酶切纯化, 将纯化产物进行测序PCR反应, 然后再进行测序前纯化。 1.2.4 测序与突变位点分析 直接测序将测序PCR纯化产物上样, 经CEQ8800型DNA全自动测序仪 (美国贝克曼库尔特公司) 直接测序, 测序结果采用Chromas 2.0软件对基因序列进行对比分析, 确定突变位点。 2 g1r基因突变 我们与Frances的测序结果均发现:患者GJB6基因上第31位碱基发生杂合突变, 鸟嘌呤 (G) 被腺嘌呤 (A) 取代;由此, 第11位氨基酸密码子由GGG突变成AGG, 导致正常的甘氨酸 (G) 被精氨酸 (R) 替代, 即G11R突变 (见图2) 。而对患者家庭中的正常人和100例健康对照进行GJB6基因的突变筛查, 并没有发现同样的碱基改变, 说明该突变是致病突变而不是单核苷酸多态性 (SNP) 。 3 gjb6基因 有汗性外胚叶发育不良是一种以毛发、牙齿、汗腺、甲发育异常为特征的常染色体遗传性疾病。发病率约为1/100 000。最初的文献报道多见于法籍加拿大人, 后来各种族中均有报道。由于临床表现多变, 多数症状不典型, 特别是与一些临床症状有交叉的疾病易混淆, 如:先天性厚甲症。先天性厚甲症主要由角蛋白 (K6a、K6b、K16和K17) 基因突变引起, 早期的研究提示HED亦可能是由于角蛋白缺陷引起的疾病。后来, 几个相互独立的研究小组通过遗传连锁分析的方法排除了角蛋白基因族为致病基因。通过全基因组关联分析将致病基因定位在 (13q11±12.1) 区域内的基因, 并通过独立的精细定位研究得以证实。位于该区域内的两个候选基因为GJB6及GJB2, 分别编码缝隙连接蛋白30 (Cx30) 和缝隙连接蛋白26 (Cx26) 。随后, GJB2作为H