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水环境中霍乱弧菌监测方法的研究进展 霍乱是霍霍乱弧菌引起的烈性肠感染。发病迅速，传播迅速，并被广泛使用。自1817年以来，它在世界各地引起了七个巨大的流行。霍乱弧菌作为霍乱的病原菌, 根据菌体 (O) 抗原不同, 已分出200个以上的O血清群, 但仅发现产霍乱毒素 (cholera toxin, CT) 的O1群与O139群霍乱弧菌可引发霍乱的流行。霍乱弧菌是自然水体的正常菌群, 是水体生态体系的一部分, 与浮游生物特别是桡足类动物存在共生关系。浮游动物特别是桡足类动物对霍乱弧菌的生存、繁殖及霍乱的传播发挥着重要的作用。由于O1群与O139群霍乱弧菌之间缺乏交叉免疫, 因此, 加强环境水体监测, 快速、准确监测出霍乱弧菌, 对于霍乱的早期预警和防控对策的制定起到决定性的影响。本研究对环境水体中霍乱弧菌监测方法进行了综述。 1 浮游生物的测定 霍乱弧菌在水环境中普遍存在, 它在水环境中的生存受多种因素影响, 如水温、水深、含盐量、降水、营养物质、浮游生物等。在这诸多因素的影响下, 水环境中霍乱弧菌为维持生存可形成活的非可培养状态 (viable but nonculturable state, VBNC) , 亦可形成生物膜, 还可依附于浮游生物、与其以共生的状态存在。 1.1 摇乱弧菌的vbnp分离和代谢 细菌的VBNC状态是细菌为适应不利环境条件的一种生存状态。处于VBNC状态的细菌缩成球形, 用常规培养方法不能生长繁殖, 但仍然处于存活状态并具有代谢活性。细菌VBNC状态是细菌为适应不利环境条件的一种存活状态, 并不是指活的非可培养的细菌。水环境中的霍乱弧菌主要以VBNC状态存在, 而且形成生物膜的霍乱弧菌也是VBNC状态。有文献报道霍乱弧菌以VBNC状态存在于摇蚊卵块中。摇蚊 (双翅目, 摇蚊科) , 通常被称为“蠓”, 在淡水区域广泛存在。以VBNC状态存在于卵块中的霍乱弧菌可以分泌一种降解卵块中胶状基质的酶, 阻止摇蚊卵的孵化, 制约环境中摇蚊的数量。在摇蚊卵块还可分离到希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌、微小杆菌, 仅发现其中极少数可分泌降解胶状基质的酶。摇蚊卵块可能是霍乱弧菌的一自然贮存宿主, 而且霍乱弧菌与卵块间的相互作用可能并非是简单的病原体-宿主的关系。 1.2 霍乱弧菌在水环境中的生物学特性 细菌生物膜是细菌在自然状态下, 由附着于无活力或活组织表面的微菌落组成的有组织、结构复杂的细菌群体生态体系。它主要由含水的、自身产生和分泌的细胞外多聚糖构成一个大的聚合体矩阵, 及包裹于其中的很多微菌落组成;呈多层次、持续增长、包含有用于营养物质输入和废物输出的通路、液体充盈、管道分离的柱形或蘑菇状三维结构, 外观呈膜状;是细菌细胞的功能性联合体。处于生物膜状态的细菌, 由于生物膜结构的稳定性, 因而大大提高了细菌的存活能力和对不利外界条件的抵抗力, 有利于细菌在恶劣环境中的生存。因此, 水环境中的霍乱弧菌通过以生物膜形式形成的微环境为其在外界不良条件下的生存提供庇护。有文献报道, 霍乱弧菌是海洋微生物食物链的一部分, 其生存受到原生动物 (食细菌的原生生物) 的制约。霍乱弧菌形成的生物膜可通过2种方式来抵挡原生动物的捕食:分泌胞外聚合物、以及依赖于一种抑制原生动物捕食活性的抗原生动物素的分泌。这种抑制作用普遍存在于霍乱致病与非致病菌株。因此, 霍乱弧菌在生物膜中可以长期保持生命力。在霍乱流行间期, 生物膜可以起到霍乱弧菌“储存库”的作用。 1.3 霍乱弧菌与浮游动物的共生关系 Colwell等通过简单的将浮游动物、大部分的浮游植物及其他20μm的微粒从水中过滤除去的方法也证明了霍乱弧菌与浮游动物特别是桡足类动物存在共生关系。大量的数据已经表明:浮游动物尤其是桡足类动物对霍乱弧菌的繁殖、生存及传播发挥着重要的作用。 2 菌株的筛选和pcr-荧光探针法检测霍乱弧菌 霍乱弧菌环境水体监测不仅要对海水、江河水及霍乱多发地区容易受到污染、或污染后容易造成人群感染的水体进行监测, 同时要对海、水产品进行监测。对于监测点获得的样品, 应使用适当的、敏感的方法对其进行检测。但是由于环境水体中, 霍乱弧菌菌量低或处于VNBC状态或仅仅是被忽略等原因, 霍乱弧菌有时不能检测出。目前, 霍乱弧菌分离检测有多种方法, 如传统分离鉴定方法、分子生物学方法、免疫学方法, 应根据样品的种类以及研究的目的进行合适的选择。 传统的培养方法被称为细菌学的金标准, 特别是需要分离到菌落时。在传统的培养方法中, 选择性培养基的使用可以减少大量的工作量, 还可以鉴别细菌的种属特性。常用的富集培养基为碱性蛋白胨水 (alkaline peptone water, APW) , 选择性培养基为庆大霉素琼脂、硫代硫酸柠檬胆盐蔗糖琼脂 (thiosulfate cit