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厚壳贻贝脂溶性提取物抗炎生物活性研究 爱贝是动物科的一个广泛分布于世界各地的疾病。我国贻贝资源丰富,是我国传统的养殖贝类,贻贝生长快、繁殖力强、抗病能力和适应性强,易于人工养殖,在我国沿海有多个品种,人工养殖的已有厚壳贻贝、紫贻贝、翡翠贻贝等数种。目前世界的贻贝年产量已超过100万t,我国的养殖产量也极大,年产量达到56.83万t,然而,贻贝在我国被认为是一种低值海产品,虽有极丰富的资源,但经济价值低,没有被充分利用,在我国贻贝主要是新鲜或粗加工后供民间食用,以活鲜品销售为主,销售范围狭窄,深加工率较低。国外流行病学、动物和人体试验研究结果显示,新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物具有显著的抗炎作用,对慢性关节炎等具有很好的疗效,目前新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物作为抗关节炎营养增补物和功能性食品已经得到广泛的应用。在我国至今没有有关贻贝生物活性研究的报道。本文以我国海洋养殖的主要贻贝品种之一厚壳贻贝(Mytilus crassitesta)为材料,通过大鼠棉球肉芽肿和佐剂诱导的关节炎模型研究厚壳贻贝脂溶性提取物的抗炎生物活性,并比较其与新西兰绿唇贻贝(Perna canaliculus)脂溶性提取物抗炎活性的高低,以期把贻贝作为具有抗炎保健功能的食品或具有自主知识产权的纯天然安全有效的新型抗炎药物开发利用提供理论基础和依据。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 厚壳贻贝由浙江舟山嵊泗科技局提供,取贻贝肉真空冷冻干燥粉碎后备用。新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物(商品名Lyprinol)购于Flavex Naturextrakte GMbH公司,消炎痛粉末(Indomethaci)由江西亚邦药业集团股份有限公司提供,香满园牌调和油为上海嘉里粮油工业有限公司生产,Freund’s完全佐剂根据Whitehouse等人的方法制备,其余所用试剂均为分析纯。 实验动物:雄性SD大鼠,体重(200.0±5.0)g,由浙江中医药大学实验动物中心提供。 1.2 灌胃剂量的确定 1.2.1贻贝脂溶性提取物的制备和实验样品准备 以真空冷冻干燥后的厚壳贻贝粉末为原料,采用Folch等人的方法以氯仿∶甲醇(2∶1,V∶V)溶液提取得到厚壳贻贝脂溶性提取物。以调和油为溶剂,提取的厚壳贻贝和新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物以及消炎痛粉末为溶质分别配成8 mg·mL-1,8 mg·mL-1,2 mg·mL-1浓度的溶液备用。 1.2.2大鼠棉球肉芽肿实验 24只雄性SD大鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常对照组(Ⅰ,阴性对照),消炎痛组(Ⅱ,阳性对照组),厚壳贻贝脂溶性提取物组(Ⅲ),新西兰绿唇贻贝提取物组(Ⅴ)。乙醚浅麻醉下,在每只大鼠腋下及两侧腹股沟皮下切口,分别塞入4个已知重量的灭菌棉球。手术当天开始Ⅰ组以调和油、Ⅱ组以消炎痛溶液(10 mg消炎痛·kg-1体重)、Ⅲ组以厚壳贻贝脂溶性提取物溶液(40 mg提取物·kg-1体重)、Ⅴ组以新西兰绿唇贻贝提取物溶液(40 mg提取物·kg-1体重)各1 mL连续灌胃7 d,第8 d处死大鼠,打开原切口,取出棉球,在60℃下烘12 h后称重,减去原重即肉芽重。灌胃剂量根据预备试验确定:40 mg提取物·kg-1体重,10 mg消炎痛·kg-1体重为抗炎效果最佳浓度。 抑制率的计算方法为: 抑制率=(对照组肉芽重-样品组肉芽 重)/对照组肉芽重×100%. 1.2.3佐剂诱导的多发性关节炎实验 SD雄性大鼠32只,随机分为4组,每组8只,分组同1.2.2,佐剂致炎前给各组大鼠灌胃7 d。第7 d时用千分尺测定大鼠双后足足跖厚度,然后于大鼠右后足足底注射0.1 mL Freund’s完全佐剂致炎,并于致炎后1、2、4、6、24 h测定右后足足跖厚度,观察贻贝脂溶性提取物对原发性病变的影响。于致炎后第9 d起,给各组大鼠灌胃15 d,隔日测定双后足足跖厚度,观察贻贝脂溶性提取物对大鼠继发性病变的影响。肿胀度以病变后足跖厚度减病变前足跖厚度得出,以Δmm表示。灌胃方法和剂量同1.2.2。 1.2.4数据统计分析 采用SPSS11.5进行统计和分析,结果表达为平均值±标准差,通过单因素方差分析比较组间差异。 2 结果与分析 2.1 各组肉芽干重等重的比较 厚壳贻贝脂溶性提取物组肉芽干重 (29.86 mg) 显著低于正常对照组 (52.23 mg), 仅稍高于消炎痛组 (25.31 mg), 而与新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物组肉芽干重等重 (29.86 mg)。这表明厚壳贻贝脂溶性提取物对大鼠棉球肉芽肿起明显的抑制作用, 其抑制率达到 42.83%, 与新西兰绿唇贻贝脂溶性提取物的抑制效果相当, 比抗炎药物消炎痛抑制效果稍差(表1)。 2.2 各组大鼠足跖水肿度 从表2可以看出,大鼠在注射佐剂后1~4 h关节炎原发性病变症状持续加重,在4 h