第二章基因工程酶学基础演示文稿.pptVIP

3）ATP浓度 一般，浓度范围在10 μmol-1 mmol/L，ATP最适的终浓度为0.5 mmol/L。 ATP浓度高至5 mmol/L，影响平头末端的连接。 ATP浓度高至7.5 mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。 本文档共96页；当前第62页；编辑于星期六\10点45分 相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。 分子越小、浓度越低越容易形成自身环化；另要注意载体与目的DNA浓度之比。 4. DNA片段末端类型与浓度 插入片段：载体= 3 : 1 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 单酶切产物连接比例需要更高。 本文档共96页；当前第63页；编辑于星期六\10点45分 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 6、平头双链DNA片段的连接操作 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 本文档共96页；当前第64页；编辑于星期六\10点45分 7、DNA连接的反应体系 DNA+vector 3:1 ligase 0.5-1 U H2O up to 10-20 ul ligase buffer 本文档共96页；当前第65页；编辑于星期六\10点45分 第三节 DNA聚合酶 1、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I、Klenow聚合酶、Taq DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、逆转录酶 本文档共96页；当前第66页；编辑于星期六\10点45分 1）共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端，催化核苷酸聚合，合成与模板互补的DNA序列 2）主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 2、常用DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 本文档共96页；当前第67页；编辑于星期六\10点45分 DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性 5’?3’外切酶活性 聚合速率 持续能力 大肠杆菌DNA聚合酶 I 低 有 中 低 Klenow fragment 低 无 中 低 T4 DNA聚合酶 高 无 中 低 T7 DNA聚合酶 高 无 快 高 化学修饰T7 DNA聚合酶 低 无 快 高 遗传修饰T7 DNA聚合酶 无 无 快 高 逆转录酶 无 无 低 中 Taq DNA聚合酶 无 有 快 高 本文档共96页；当前第68页；编辑于星期六\10点45分 本文档共96页；当前第69页；编辑于星期六\10点45分 3→5外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3→5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3→5外切酶活性所降解。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3→5外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3→5外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。 本文档共96页；当前第70页；编辑于星期六\10点45分 6、影响限制性内切酶活性的因素 1）. DNA样品的纯度 加大酶的用量，1ugDNA用10U酶 扩大反应体积（ 20?l） 延长保温时间 添加阳离子亚精胺 一般采取 在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。 本文档共96页；当前第30页；编辑于星期六\10点45分 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： 2） DNA的甲基化程度 DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam) （修饰GATC中的A）； DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。 哺乳动物的DNA通常在鸟嘌呤核苷残基的5侧也发生甲基化。甲基化程度与DNA来源的细胞