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第十章 化学发光免疫 分析技术 发光免疫分析:是将发光分析和免疫反 应相结合而建立起来的一种新的检测 微量抗原或抗体的新型标记免疫分析 技术。 第一节 概 述 发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态 （较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回 到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。 光照发光（photoluminescence）是指发光 剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子 吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时， 发射出较长波长的可见光（荧光）。 生物发光（bioluminescence）是指发生在生物 体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为 萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP 能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时 多余的能量以光子的形式释放出来。 一、化学发光 化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反 应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂) 在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能， 使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃 迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发 射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。 一些化学反应能释放足够 的能量把参加反应的物质激 发到能发射光的电子激发态， 若被激发的是一个反应产物 分子，则这种反应过程叫直 接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C＋ h·γ 其中 γ为光子，C*表示C处于单线激发态。 若激发能传递到另一个未参加化学反应 的分子D上，使D分子激发到电子激发态， D分子从激发态回到基态时发光，这种过 程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h·γ 二、化学发光效率 化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化 学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（ φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能 量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决 定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光 谱和不同的化学发光效率。 第二节 化学发光剂和标记技术 一、化学发光剂 在化学发光反应中参与能量转移并最终 以发射光子的形式释放能量的化合物，称为 化学发光剂或发光底物。 能作为化学发光剂的条件： ①发光的量子产率高； ②它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配； ③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④ 其化学发光常是氧化反应的结果； ⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 ㈠直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需 酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在 化学 构上有产生发光的特有基团，可直接 标记抗原或抗体。 1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化 时,发出波长为470nm的光，具有很高的发 光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶酮是 该发光反应体系的发光体。 2．三联吡啶钌 三联吡啶钌 [RU(bpy)3]2+是 电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA） 在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化 反应。 三联吡啶钌 电化学发光剂反应原理 ㈡ 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。 1．鲁米诺及其衍生物 2．AMPPD 1．鲁米诺 鲁米诺发光原理 鲁米诺增强发光反应原理 2．AMPPD 〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,