硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶的测定.docx

硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定 摘要 本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原 酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。 关键词 小麦 硝酸还原酶 谷氨酰胺合成酶 酶活性 引言 硝酸还原酶（NR）是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过 程中起催化作用。同时，它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重 要影响［1］。就植物的生长和发育而言，氮素的同化是个十分重要的生理过程。 其中，无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利 用。谷氨酰胺合成酶（GS）是高等植物氮代谢中十分重要的酶，它和谷氨酸合 成酶联合作用，催化氨的同化，使其转变成Gln和Glu ,在小麦植物体内含氮 有机物的生物合成中作为N的供体［2］。 1、实验材料与方法 1.1实验材料与试剂 小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝 酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨 基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二 醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺 苷（ATP）。 1.2实验原理 1.2.1硝酸还原酶活性的测定 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还 原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及a- 萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。此红色偶氮化 合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。故硝酸还原酶活性可由 产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。 1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存 在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺， 实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可 用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。但在该实验设计反应体系中， 谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成Y-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸 性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可 用分光光度计测定。因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的Y -谷氨酰基异 羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来 表示，单位为：A*mg-3 （protein） ?h-i。 1.3实验步骤 1.3.1硝酸还原酶活性的测定 1.3.1.1标准曲线制作 取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。摇匀后在30°C下水浴20min，然 后在540nm下比色。以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。 符 号 1234567 亚硝酸钠标准液 试剂(ml 试剂 (ml ) 蒸馏水 1%磷胺 0.02% a- 萘胺 酶管含亚硝态氮 （ug） 0.00.20.40.81.21.62.0 2.01.81.61.20.80.40.0 4.04.04.04.04.04.04.0 4.04.04.04.04.04.04.0 0.00.20.40.81.21.62.0 1.3.1.2硝酸还原酶活性测定 植株预处理、取样、酶活性反应：先往对照瓶中加入1ml终止液，然后往 3个瓶中均加入9ml反应液；混匀后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min （期 间停顿几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底）；之后将各瓶在 30^、黑暗条件下静置反应30min；反应时间到，立即往两个测定瓶中加入1ml 终止液；将各瓶摇匀，再静置3min。最后进行显色反应，根据标线求得亚硝态 氮含量。计算硝酸还原酶活性。 1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的测定 1.3.2.1酶液的提取 称取植物叶片1.0g，置于预冷研钵中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成 匀浆，转移于寓心管中，在4P下、15.000转离子20min，上清液即为酶液。 1.3.2.2谷氨酰胺合成酶活性测定 取3支试管，分别加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入 1.6ml反应混合液A （作为对照管），另外2支各加入1.6ml反应混合液B （作 为反应管），混匀后，将3支试管均置于37°C水浴下反应30min；反应结束后，3支试管均立即加入1ml显色液，摇匀，静置片刻后，取上清液在540nm 处测定吸光值（用酶液提取液调零），根据吸光值计算酶活性。 1.3.2.3酶液中可溶性蛋白含量测定（采用紫外吸收法） 取酶液0.3ml，用蒸馏水定容至100ml，分别在260nm和280nm下测定吸光 值（用蒸馏水调零），根据公式计算酶液中可溶性蛋白含量。 2、实验结果与分析 2.1硝酸还原酶活性的测定 2.1.1标准