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第二章基因工程基本技术原理-DNA序列测定西北师范大学精品课程武国凡基因工程第二章基因工程基本技术原理-DNA序列测定西北师范大学精品课程武国凡基因工程第二章基因工程基本技术原理序列分析演示文稿本文档共27页；当前第1页；编辑于星期六\10点43分优选第二章基因工程基本技术原理序列分析本文档共27页；当前第2页；编辑于星期六\10点43分2.5.1Sanger双脱氧链终止法■2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法■2.5.3序列分析自动化■2.5.4杂交测序■2.5.5DNA策序的商业运作及存在问题■2.5.6思考问题■本文档共27页；当前第3页；编辑于星期六\10点43分2.5.1Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。返回DNA核酸序列分析历程本文档共27页；当前第4页；编辑于星期六\10点43分引物—延伸测序策略1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。本文档共27页；当前第5页；编辑于星期六\10点43分2.5.1.1Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。也称引物合成法，或酶催引物合成法。本文档共27页；当前第6页；编辑于星期六\10点43分反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。本文档共27页；当前第7页；编辑于星期六\10点43分GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你本文档共27页；当前第8页；编辑于星期六\10点43分酶、原料比例dNTP／ddNTP=100：1时，谱带分离效果较佳，可读出多于200个以上的核苷酸顺序。降低dNTP对ddNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。本文档共27页；当前第9页；编辑于星期六\10点43分2.5.1.2Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。费时、费力、费钱、DNA损伤严重本文档共27页；当前第10页；编辑于星期六\10点43分克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。本文档共27页；当前第11页；编辑于星期六\10点43分M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定LacZ区段中重组体噬菌体在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑;非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。本文档共27页；当前第12页；编辑于星期六\10点43分这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。