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四、实验步骤（一）、碱法1.接种少许通过PCR鉴定含有重组质粒DH5α菌液到液体LB培养基(含100μg/mlAmp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期；。2、取菌液入1.5mlEP管中,4℃，8,000rpm,5min;3、弃上清,将管倒置于吸水纸上数分钟,使液体流尽；4、菌体沉淀重悬浮于200μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)；5、加入新配制的溶液Ⅱ400μl,接近水平旋转EP管,以混匀内容物(不要振荡),冰浴5分钟。6、加入300μl预冷的溶液Ⅲ,温和转动EP管至絮状沉淀出现，冰浴中5-10分钟,4℃，12,000rpm,10min;7.上清液移入干净EP管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),混匀,4℃,12,000rpm,5min;8.将水相移入干净EP管中,加入等体积的氯仿，混匀，4℃,12,000rpm,5min;9.将水相移入干净EP管中,加入2倍体积的无水乙醇,1/10体积的NaAc,振荡混匀后置于-20℃冰箱中10min，然后4℃,12,000rpm，10min；10.弃上清,将管口敞开倒置于吸水纸上使所有液体流出,加入70％乙醇洗沉淀一次,4℃,12,000rpm，5min；11.吸除上清液,将管倒置于吸水纸上使液体流尽,室温干燥。12.将沉淀溶于20μlddH2O中,加入1-2lRNaseA,37℃水浴中温育2-3h.（二）质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI）1.接种少许通过PCR鉴定含有重组质粒DH5α菌液到液体LB培养基(含100μg/mlAmp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期；2.取菌液入1.5-5mlEP管中,10,000g,室温离心1min;3.加入250μlSolutionI/RNaseA振荡重悬细菌；4.加入250μlSolutionII温和混匀2min以上；5.加入350μlSolutionIII，迅速颠倒EP管数次，充分混匀，直到絮状沉淀出现；6.12,000g,室温离心10min;7.取上清加入到纯化柱中，10,000g,室温离心1min;8.倒掉滤液，加入500μlBufferHB洗纯化柱，10,000g,室温离心1min;9.倒掉滤液，加入700μlDNAwashbuffer洗纯化柱，10,000g,室温离心1min,倒掉滤液;10.13,000g,室温离心空纯化柱2min；11.将纯化柱放入新的EP管上，加入30-50μl的ElutionBuffer,室温放置1-2min;12.13,000g,室温离心1min洗脱DNA;实验九重组质粒及表达载体pET酶切分析一、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶可分为三类:Ⅰ类和III酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA；III类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。分子克隆中广泛应用的是：Ⅱ类中的限制性内切酶。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘-G↓AATTC-3’),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端（5’-G↓AATTC-3’）。BamHINdeI影响酶切反应的因素1.DNA纯度2.缓冲液3.温度条件4.甘油含量Takara公司提供的不同缓冲液BamHINdeI温度：30或37OC（BamHI30OC；NdeI37OC）甘油：控制在10％以下二、实验目的1掌握限制性内切酶酶切反应原理和方法；2将上一实验获得的重组质粒及表达载体pET进行限制性内切酶消化仪器及耗材：台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、恒温水浴锅。材料：