DB64T 1682-2019包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法.docxVIP

2019-12-18发布ICS67.050

2019-12-18发布

X04DB64

宁夏回族自治区地方标准

DB64/T1682—2019

包装饮用水中

铜绿假单胞菌的快速检测方法

宁夏回族自治区市场监督管理厅

2020-03-17实施

发布

I

DB64/T1682—2019

前言

本标准是按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。

本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口并组织实施。

本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。本标准主要起草人：邓军、高俊峰、夏莉娟、冯秀娟、赵艳、李雯、董川。

1

DB64/T1682—2019

包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法

1范围

本标准规定了包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌检测的环介导恒温核酸扩增(LAMP)的方法。

本标准适用于包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3缩略语

DNA(deoxyribonuclelcadd):脱氧核糖核酸。

dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脱氧核苷三磷酸。

LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):环介导恒温扩增。

OprL:编码OprL蛋白(肽聚糖相关外膜脂蛋白)的基因。

TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚。

4生物安全措施

按照GB19489中的有关规定执行。

5防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27403的规定。

6原理

根据铜绿假单胞菌特异OprL基因序列(参见附录A)设计的两对特殊的内、外引物及一对环状引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应。BstDNA聚合酶具有强链置换能力，能在63℃这一恒温条件下实现对目标基因的扩增，在铜绿假单胞菌OprL特异基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成很多类似花椰菜结构的茎环DNA混合物。

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DB64/T1682—2019

当发生扩增反应时，反应体系中添加的染色剂(SYBRGreenI)能以嵌入方式结合到扩增出来的DNA混合物小沟处，随着双链DNA的增加，SYBRGreenI染料荧光信号随之增强，通过荧光定量PCR仪实时监测产物扩增情况，从而达到检测目的基因是否得到扩增。根据Ct值以及是否有“S”型扩增曲线判定结果。

7试剂与材料

7.1引物

外引物扩增片段长度：269bp

外引物1(F3,5-3):GCGTTGCCGCCAACAATG

外引物2(B3,5-3):CATGCGGGCAACCTCTC

内引物1(FIP,5-3):GTTGTCACCCCACCTCCGGGCGGCAACGTTCCTCC

内引物2(BIP,5-3):CTCCGTGCAGGGCGAACTGCAGGCGAGCCAACTC

环状上游引物(LF,5-3):ACCTGCCGTGCCATACC

环状下游引物(LB,5-3):GTTCATGCAGCTCCAGCAG

7.2试剂材料

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。——脑心浸液肉汤(BHI);

——DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒；

——BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL;

——dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP,每种核苷酸浓度10mmol/L;

——10×ThermoPol缓冲液含：0.2mol/LTrisHCl,0.1mol/L氯化钾，0.1mol/L硫酸铵，20mol/L硫酸镁，1%TritonX-100;

——硫酸镁：50mmol/L;

——甜菜碱：