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X04DB64

宁夏回族自治区地方标准

DB64/T1681—2019

食品中沙门氏菌

和金黄色葡萄球菌的快速检测方法

2019-12-18发布2020-03-17实施

宁夏回族自治区市场监督管理厅发布

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DB64/T1681—2019

前言

本标准是按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。

本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口并组织实施。

本标准起草单位：宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。本标准主要起草人：冯秀娟、夏莉娟、邓军、高俊峰、董川、赵艳、李雯。

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DB64/T1681—2019

食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球的快速检测方法

1范围

本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌检测的环介导恒温核酸扩增(LAMP)的方法。

本标准适用于食品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3缩略语

DNA(deoxyribonuclelcadd):脱氧核糖核酸。

dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脱氧核苷三磷酸。

femA:金黄色葡萄球菌的甲氧苯青霉素耐药有关的基因。

fimI:沙门氏菌I型菌毛蛋白调控基因。

LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):环介导恒温扩增。

TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚。

4生物安全措施

按照GB19489中的有关规定执行。

5防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27403的规定。

6原理

利用环介导恒温扩增(LAMP)技术进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的筛选检测。根据金黄色葡萄球菌特有的femA基因序列(参见附录A),沙门氏菌fimI基因序列(参见附录B)分别设计一套特异性引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域。利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，分别在金黄色葡萄球菌femA特异基因序列、沙门氏菌fimI特异基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成很多类似花椰菜结构的茎环DNA混合物。当发生扩增反应时，反应体系中添加的染色剂 (SYBRGreenI)能以嵌入方式结合到扩增出来的DNA混合物小沟处，随着双链DNA的增加，SYBR

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DB64/T1681—2019

GreenI染料荧光信号随之增强，通过荧光定量PCR仪实时监测产物扩增情况，从而达到检测目的基因是否得到扩增。根据Ct值以及是否有“S”型扩增曲线判定结果。

7试剂与材料

7.1引物

PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定。

表1PCR反应使用的引物序列

菌株

目标基因

引物名称

序列(5-3)

扩增片段大小(bp)

金黄色葡

萄球菌

femA基因

F3

TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT

231

B3

TTTTCATAATCRATCACTGGAC

FIP

CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGATAGCATGC

CCATACAGTC

BIP

ACAATAATAACGAGGTCATTGCAGCTTTTCTTGAACACTTT

CATAACAGGTAC

沙门氏菌

fmI基因

F3

CACTAAATCCGCCGATCAA

262

B3

CAACGGTGAGGAGGTATTATC

FIP

TTCGGATCGCAGTCATTCAGGCGATTGGTGATACGACCG

BIP

GGTCAGGCAGATAACACCAACATTGCGGTGGTGCTATTATC

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