酶的提取与分离纯化.pptVIP

薄层层析板薄层层析硅胶板薄层层析微晶纤维素板第190页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三三、离子交换层析

(ion-exchangecolumnchromatography)离子交换层析：利用吸附在离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种物质的吸附力不同而使不同物质分离的方法。离子交换剂：是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子化合物（惰性载体）第191页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三离子交换剂分成两部分：（1）一部分是不能移动的多价的高分子基团，构成树脂的骨架，使树脂具有不溶于水和化学稳定的性质；（2）另一部分是可移动离子，称为活性离子，它在树脂骨架中进出而发生离子交换现象。高分子惰性骨架和单分子活性离子带有相反电荷而共处于离子交换树脂中。第192页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。（一）离子交换层析的原理第193页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上。第194页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三离子交换剂的类型（1）离子交换树脂（疏水性）最常用的是：不溶性母体：由人工合成疏水的苯乙烯、二乙烯苯合成的聚合物树脂（进行聚合和交联反应生成的具有三维网状结构的高聚物)第195页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三阳离子交换树脂：引入活性基团：酸性基团，可与其它X＋交换离子交换：R-A－H++X+=R-A－X++H+强酸型:含磺酸基团(-R-SO3H)中强酸型:含磷酸，亚磷酸根弱酸型:含-COOH或-OH第196页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三阴离子交换树脂：引入活性基团：碱性基团，可与其它Y－交换强碱型树脂：如含季胺盐[-N+(CH3)3]中强碱型树脂：含叔胺[-N(CH3)2]弱碱型树脂：仲胺[NHCH3]、伯胺[-NH2]第197页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三离子交换树脂D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂阴离子交换树脂第198页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三（2）离子交换纤维素（亲水性）对pr.和核酸的纯化极为有用的，因为它具有亲水性的松散网状结构，表面积较大，大分子可以自由通过。交换容量大，洗脱条件温和，回收率高。常用的离子交换纤维素：8种（强酸、强碱、弱酸、弱碱型）。以二乙胺基乙基纤维素即DEAE－纤维素、羧甲基纤维素即CM－纤维素最普遍。阳离子交换剂：羧甲基纤维素（CM）（弱酸型）阴离子交换剂：二乙基氨基纤维素（DEAE）（弱碱型）第199页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三酶是两性电介质，故可用阳离子交换树脂，也可用阴离子交换树脂进行分离纯化。（1）在溶液pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换树脂进行层析分离；（2）pH值小于等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子交换树脂。第200页，讲稿共284页，2023年5月2日，星期三（3）离子交换凝胶以交联葡聚糖凝胶（Sephadexgel）作为交换剂母体，再引入不同的活性基因，制成各种类型的离子交换葡聚糖。特点：对生物活性物质是一个十分温和的环境（又兼备分子筛效应），交换容量很大，是上述的3～4倍，装柱后流动相在柱内，流动的阻力较小，流速理想，最适用于大分子的分离纯化。如：DEAE－SephadexA25,A50（电荷基团：二乙胺基乙基）(分别以G25和G50两种规格葡聚糖凝胶制成)CM－SepharoseC25，C50（电荷