蛋白质和多肽的氨基酸序列分析.pptVIP

二、肽链的部分降解三、肽段的分离提纯第三节亚基拆离、肽链降解和肽段的分离一、亚基拆离和二硫键的断裂第87页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三一、亚基拆离和二硫键断裂蛋白质由一条以上的肽链组成时，肽链间的结合可能是靠非共价键结合，也可能是靠共价键结合。在进行肽链顺序分析时，首先要将它们分离开来。若多亚基间以非共价键连接，在温和条件下即可以拆离亚基，如改变溶液pH，将pH降低到3～4或升高到9～10；或者加入变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍等。例如，血红蛋白经8mol/L脲处理后，α及β链可以得到分离；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2mol/L巯基乙醇及1%SDS溶液中保温1小时，大小亚基便相互分开。拆离后的亚基可以用凝胶过滤方法进行分离。第88页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三拆分靠共价键结合的因比较牢固须用特殊的化学作用使其破坏。最常见的是半胱氨酸残基经氧化作用而形成胱氨酸残基，即二硫键结构。第89页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三1．过甲酸氧化法优点：能将巯基（-SH）和二硫键（-S-S-同时氧化成磺基，生成的磺酸基很稳定，肽链不再重新形成二硫键，便于肽链分离。缺点：氧化过程中，同时将蛋磺酸的侧链氧化成亚砜，色氨酸的侧链也遭破坏。第90页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三2．还原法一般可使用过量巯基化合物，如β-巯基乙醇。在室温或pH8～9条件下放置数小时，即可使二硫键还原成巯基。加入8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性。在这种情况下，还原剂才能有效地作用于暴露的二硫键。二硫键还原后，需要用巯基保护试剂，如碘乙酸，以防其重新被氧化。第91页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三2、PTC-AA实验操作：氨基酸或样品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50ul偶联试剂(乙醇:三乙胺:水＝7:1:1)中。此溶液在旋转真空干燥后再次溶解于50ul偶联试剂中，然后加入2ulPITC(异硫氰酸苯酯)，反应混合物在250C下保温15min，再次旋转真空干燥，真空度(1.3~13Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在适量流动相A中，取一部分上柱定量分析。第55页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三仪器为BeckmanGoldSystemHPLC仪，反相柱RP-18(250mm×4.6mm)或PTH-柱，254nm检测。流动相：A50mmol/L乙酸钠，pH6.8B50mmo1／L乙酸钠，pH6.8:乙腈＝50:50HPLC柱采用水浴夹套40℃恒温，并用5％流动相B平衡。梯度条件是：0min,5%B,5min,5％-15％B,10min,15％B；30min,15％~60％B,40min,60~5％B流速是1ml／min。第56页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三第57页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三3、茚三酮法实验操作：水解后氨基酸样品溶解于Na-S样品稀释液中100u1上样分析，实际进样量50ul(100pmol~5nmol，均呈线性)。第58页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三仪器：Beckman6300氨基酸分析仪。流动相：Na-E0.0min温度：0.0min48℃Na-D27.80min11.8min65℃Na-F39min32.5min77℃Na-R76.00min50min48℃Na-E77.00-90min流速：缓冲液14ml/h茚三酮7ml/h第59页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三第60页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三第二节

蛋白质的末端测定第61页，讲稿共130页，2023年5月2日，星期三