2024凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素 .docxVIP

2024凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺

激素

基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。选用SephadexLH-20凝胶小柱对150μL血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，采用LC-MS/MS法进行检测和定量，并进行方法学验证。结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(r2)均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为1.8%～10%,准确度为85.4%~110%,基质效应为85.8%～114%,回收率为85.8%～107%。采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSSStatistics26和MedCalc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PassingBablok回归分析和Bland-Altman一致性分析。结果表明，GFC/LC-MS/MS与ED/LC-MS/MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P0.05)。所建立的方法快速、简便，受干扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提

供了一种新的思路。

三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,

T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状

腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发生风险。正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4。而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关。FT3和FT4的测定不受血清结合蛋白的影响，是甲状腺功能体外实验的灵敏指标，可作为甲亢、甲减、甲状腺肿、重症

感染发热等疾病的辅助诊断。

由于血清中FT3和FT4临床检测的重要性，50多年来研究者们相继开发了测定FT3和FT4的不同方法。但由于游离甲状腺激素的浓度极低，FT3的血液浓度为1.4~6.0pg/mL,FT4为8.0~20.0pg/mL。并且结合态与游离态之间的内源性平衡易受到扰乱，使得其检测结果的重复性、稳定性较差。因此，临床上准确检测游离甲状腺激素仍然十分困难，极具挑战性。目前，临床实验室通常通过免疫分析方法或物理分离方法检测FT3或FT4。通过免疫法间接测定的FT3、FT4含量易因其动态平衡被破坏而有误。尤其是在妊娠期，由于其结合蛋白的显著变化和嗜异性抗体的存在，使得免疫测定结果不准确。美国甲状腺协会建议，在妊娠期测定FT4的最佳检测方法为液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法。该法分析灵敏度高、特异性好，已成为国外检测人血清中FT3、FT4的金标准方法。在结合态与游离态之间的内源性平衡受干扰最小的情况下，从血清中分离出FT3和FT4是该方法

前处理环节的关键。经过多年的发展与改进，平衡透析和超滤已成为

较为成熟和完善的物理分离技术，然而这两种方法均因其自身的局限

性，尚未推广到大多数临床实验室。

凝胶过滤层析(GFC),利用分子筛作用和选择性洗脱，可以实现蛋白结合态和游离态的快速分离，加之凝胶载体的惰性高、吸附力弱，能够减小对内源性平衡的干扰。1979年，Romelli等将凝胶过滤层析用于游离甲状腺激素测定，证实了该方法不会显著改变血清中的游离激素水平。在此基础上，本研究拟采用GFC技术，通过进一步优化，减少样本量，简化操作步骤，建立可靠的快速前处理方法，实现高通量样本检测，使其适用于临床检测实验室。在此基础上，基于LC-MS/MS技术建立高灵敏检测方法，以实现临床游离甲状腺激素的高灵敏、稳定、快速检测，为甲状腺激素临床相关疾病的诊断、预防、

治疗、预后和监测等提供支撑。

1实验部分1.1仪器与装置

LCMS-8050CL岛津液相色谱三重四极杆质谱仪(日本Shimadzu公司);PCWJ-10超纯水机(成都品成科技有限公司);涡旋混匀仪(金坛区白塔新宝仪器厂);QB-800296孔板混匀仪(海门市其林

贝尔仪器制造有限公司);BT25S型十万