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发酵液中麦角硫因的测定高效液相色谱法

1范围

本文件规定了发酵液中麦角硫因的高效液相色谱检测方法。

本文件适用于麦角硫因发酵液中麦角硫因的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验用水规格和实验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中的麦角硫因经热水提取或直接稀释，定容过滤后，利用高效液相色谱仪经亲水反相色谱柱分

离后，用紫外检测器检测，外标法定量。

5试剂和材料

5.1水：GB/T6682，一级水。

5.2乙腈：色谱纯。

5.3乙腈溶液：量取乙腈3mL，加水至100mL。

5.4麦角硫因标准品（CHNOS，CAS：497-30-3）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质

91532

证书的标准物质。

5.5麦角硫因标准储备液（1.0mg/mL）：称取麦角硫因标准品0.1g，精确至0.0001g，加水溶解并

定容至100mL，4℃以下保存，有效期3个月。

5.6麦角硫因标准系列工作液：分别移取麦角硫因标准储备液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，

分别加水定容至100mL，混匀。麦角硫因标准系列工作液的浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、

60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL。4℃保存，临用现配。

6仪器和设备

6.1分析天平：感量为0.0001g和0.00001g。

6.2具塞锥形瓶：150mL。

6.3水浴恒温磁力搅拌器：20℃～100℃可调，搅拌转速50r/min～500r/min可调。

6.4离心管：10mL。

6.5离心机：转速500r/min～5000r/min可调。

6.6微孔滤膜：0.22μm，水相。

6.7高效液相色谱仪：配紫外检测器。

7分析步骤

1

7.1试样溶液的制备

7.1.1发酵混合液

量取发酵混合液1mL置于150mL具塞锥形瓶中，加水至约60mL，制成菌体悬液。置于95℃水浴

中，以200r/min转速搅拌提取30min后，冷却至室温，将该发酵混合提取液加水定容至100mL，摇匀，

微孔滤膜过滤。此发酵混合提取液应经适当的稀释，使麦角硫因浓度在标准曲线范围内。

7.1.2发酵清液

量取发酵混合液1mL置于10mL离心管中，5000r/min离心10min后倒出上清液，定容至100mL，

摇匀，微孔滤膜过滤。此上清液的麦角硫因浓度应在标准曲线范围内。

7.1.3发酵菌体

量取发酵液混合1mL置于10mL离心管中，5000r/min离心10min后倒出上清液，用约60mL水将离

心管中剩余的菌体完全洗入150mL具塞锥形瓶中，制成菌体悬液。将菌体悬液置于95℃水浴中，以200

r/min转速搅拌提取30min后，释放细胞内麦角硫因，冷却至室温，将发酵菌体提取液加水定容至100mL，

摇匀，用微孔滤膜过滤。此发酵菌体提取液应经适当的稀释，使麦角硫因浓度在标准曲线范围内。

7.2液相色谱参考条件

7.2.1色谱柱：SB-Aq，250mm×4.6mm×5μm，或等效的亲水柱。

7.2.2柱温：30℃。

7.2.3检测波长：257nm。

7.2.4流动相：乙腈溶液。

7.2.5流速：0.7mL/min。

7.2.6进样量：10μL。

7.3标准曲线的制作

将麦角硫因标准系列工作液，按浓度由低到高的顺序分别注入液相色谱仪中，测得相应的色谱峰面

积，以标准系列工作液中麦角硫因的浓度为横坐标，以对应麦角硫因的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

麦角硫因标准溶液（10μg/mL）液相色谱图参见附录A中图A.1。

7.4试样溶液的测定

将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根