酶工程3-1课件_可编辑.pptVIP

共价结合（偶联）法是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。（二）结合法——共价结合法共价结合（偶联）法：酶蛋白N末端的α-氨基、赖氨酸残基的ε-氨基、C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基、谷氨酸残基的γ-羧基、苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环、半胱氨酸残基的巯基、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基、组氨酸残基的咪唑基、色氨酸残基的吲哚基。最普遍的是氨基、羧基和苯环酶蛋白上可供载体结合的功能基团：（二）结合法——共价结合法常用载体：天然高分子：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉、壳聚糖、胶原及衍生物等人工合成的高聚物：尼龙、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺衍生物等无机载体：多孔玻璃、金属氧化物等（二）结合法——共价结合法常用载体及载体上常用的基团：载体上与酶偶联的基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基载体要求：亲水；有一定的机械强度和稳定性；同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团；很少有非专一性吸附；来源容易，能反复使用反应要求：偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。

（二）结合法——共价结合法共价结合法特点：酶与载体连接牢固，不易脱落反应条件严格，操作条件复杂活性中心易遭破坏

共价键结合法制备固定化酶的“通式”首先载体上引进活泼基团关键然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键（二）结合法——共价结合法载体活化方法：A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法（二）结合法——共价结合法A．重氮法带芳香氨基侧链的载体，先用亚硝酸和稀盐酸处理成重氮衍生物，再在中性偏碱（pH8-9）的条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。重氮盐通常能与酶分子上酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基形成相应的偶氮衍生物，也能有α-氨基或ε-氨基与两分子重氮盐反应的双偶氮化合物该方法需要载体具有芳香族氨基目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等A．重氮法反应示意式如下载体：β-硫酸酯乙砜基苯胺（ABSE）多糖A．重氮法5′-磷酸二酯酶的固定化。此酶可以在温和条件下非特异性水解DNA和RNA分子上的磷酸二酯键，可分离得到四个5′-单核苷酸，用于核酸鉴定和DNA测序以及5’-核苷酸生产（多种药物前提）本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶A．重氮法方法如下：纤维素-OH的活化：0.6%NaOH调pH13,加热85℃，30min醚化：先把SESA以1：2的水浸泡，在40℃时用1MNa2CO3调pH为6.5，除去渣，以SESA：纤维素=1：1（干重）在pH13，85℃，醚化30min，即得到ABSE-纤维素。A．重氮法去除多余的苯胺基(用0.5MNaOH洗三次，水洗至无色）重氮化盐制备：用5%NaNO2及1MHCl在10℃以下反应15min，然后用预先冷却的0.05MHCl及H2O洗涤抽干即成。偶联：先在酶液中加入硫酸铵（1：0.007）,然后调pH值6.5，加入经重氮化的ABSE-纤维素，再调PH值7.0，在冰浴中反应两小时，过滤，洗涤抽干即为固定化酶，A．重氮法B．叠氮法将带有羧基、羟基或羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理，实质酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成跌单衍生物。可在低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与-NH2反应。B．叠氮法将带有羧基、羟基或羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理，实质酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成跌单衍生物。可在低温下与酶蛋白的羟基、酚基或巯基反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与-NH2反应。此法常用载体有羧甲基纤维素，羧甲基葡聚糖凝胶（CM-Sephadex），聚天冬氨酸等用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗