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微孔滤膜过滤除菌

关键词：硝酸化学试剂氯化钠菌种试剂标准物质北京标准物质网

一、实验目的要求

（1） 了解过滤除菌的原理。

（2） 掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。

二、基本原理

尽管有报道称原核细菌小至纳米（10-9m）级，大可达0.1?0.3mm甚至

0.75mm（非洲纳米比亚球菌），一些真核微生物如蘑菇、木耳等担子菌也非常大。但绝大部分微生物都是微米级（10-6mm），常用的微孔滤膜可以把绝大部分细菌分离开来。过滤除菌是根据微生物的大小，如原核微生物的尺寸为1?10pm（球菌0.5?2.m,杆菌长1?邹m、宽0.5?川m,螺旋菌长5?50pm、宽0.5?5.m）,真核微生物的尺寸为10?100.m（粗略地说，真核微生物和原核微生物大小存在10：1的递减规律），选择孔径不同的滤膜，通过机械作用滤去液体或气体中微生物的方法（图1—2）。

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这是一种非杀灭性除菌方式，实际上达到菌液分离的效果。具体实验应根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。市面上常见的微孔滤膜有醋酸纤维酯和

硝酸纤维酯滤膜等，孔径有0.025pm、0.05pm、0.10pm、0.20pm、0.22pm、0. 30pm、0.45p m、 0. 60p m、 0. 65pm、0.80pm、1.00pm、2.00pm、

00pm、5.00p m、7. 00p m、8. 00pm和10.00pm等，实验室除菌用一

般选择0.22pm,但除病毒需选择更小孔径的滤膜。大滤板有石棉滤板、K型滤板（孔径最大，作一般澄清用）、EK滤板（滤孔较小，用以去除一般细菌）、EK-S滤板（滤孔最小，可阻止大病毒通过）。

此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，适用于酶、朊、核酸、抗生素、病毒等活性分子的过滤，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。随着反渗透技术的逐渐成熟和成本下降，大规模的过滤除菌工业应用也已经出现:在矿泉水、纯净水生产制作过程中已有应用。

三、实验材料与设备

培养基

2%的葡萄糖溶液（葡萄糖试剂需满足HG/T3475—1999《化学试剂葡萄糖》要求）、肉汤朊胨琼脂培养基（平皿）、营养肉汤。

肉汤朊月东琼脂培养基配制:朊月东10g，牛肉膏5g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，琼脂16g，调节pH至7.2，分装克氏瓶，每瓶150mL，121°C、20min灭菌，后平放成平板。营养肉汤类有YY/T1187—2010《营养肉汤培养基》可作参考，配制：朊胨10.0g，牛肉粉3.0g，NaCl5.0g（品质应满足GB/T1266—2006《化学试剂氯化钠》），pH值7.2±0.2（25C），加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶或试管，121C高压灭菌15Dmin备用。

如无特殊说明，本书及附录中所有药品均为市售分析纯（AR）或生物化学纯（BR）或以上纯度级别试剂，蒸馏水为双蒸水或去离子水，所有市售化学药品应满足有关国家法律法规、标准和/或技术规范等。我国已经制定实施的化学试剂标准有280多条，如GB/T1266—2006《化学试剂氯化钠》等，为了方便阅读，在本书相应首次提及的地方，都作了提示。

仪器或其他用具

注射器、微孔滤膜过滤器、0.22pm/0.45pm滤膜、无菌试管、镊子、玻璃刮棒、真空泵或水泵、砂芯过滤装置。

有关装置至少应满足GB/Tu41589《实验室烧结（多孔）过滤器孔径、分级和牌号》等的要求。

四、操作步骤

1.大量液体过滤除菌

将0.22〃m孔径的滤膜装入清洗干净的砂芯过滤装置中，旋紧或稍真空抽滤，压平（如用一次性预灭菌的带膜针式滤头则无此步骤），包装灭菌（0.1MPa、121.5°C灭菌20min）后待用。

2.针孔过滤器

将灭菌滤器的入口在无菌条件下以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌容器中（图1一3）。

压滤

将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕将针头拔出。

注意：压滤时，用力要适中，不可太猛、太快，以免细菌被挤压通过滤膜。

无菌检查

以无菌操作吸取除菌滤液0.1mL或者直接将滤膜培育于朊胨琼脂平板上，涂布均匀，置37°C温室中培养24h,检查是否有菌生长。

清洗

弃去砂芯过滤装置上的微孔滤膜，将砂芯过滤装置清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜组装包扎，再经灭菌后使用。

注意