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第五章双水相萃取技术

(AqueousTwoPhaseExtraction);双水相萃取(aqueoustwo-phasepartitioning)是1896年Beijerinck把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的别离和纯化，并逐步向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。;双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度到达一定值时，就会分成不互溶的两相。

因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。;现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液别离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加外表活性剂产生反胶束的方法可克服这些问题，但同样存在相的别离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的别离纯化技术。其中双水相萃取技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型别离技术。;一、双水相萃取的根本特性;可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。;各种类型的双水相体系;常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran体系一般用于小规模地别离生物大分子、膜、细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。

物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗粒的分配情况那么由分配比P来表征。影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、温度等。;双水相萃取的根本特点;(2)与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。

(3)聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进而到达目的产物的最正确萃取条件。

(4)可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中参加PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间，又防止了胞内酶的损失。;(5)能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合，即生物反响在其中一相中进行，同时生成的反响产物被连续萃取到另一相中。不仅解决了产物反响抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，活性更大。因为生物反响和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生产。;(6)亲和萃取(亲和分配)可大大提高分配系数和萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白