《益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法》征求意见稿.docx

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T/xx001—2023

益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法

1范围

本文件规定了益生菌产品活菌计数及代谢活力的术语和定义、描述了益生菌活菌计数方法和代谢活力的拉曼光谱检测方法。

本文件适用于含益生菌产品的活菌计数及代谢活力检测。包括添加的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和嗜热链球菌等一种或多种菌种。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

T/CIFST009-2022食品用益生菌通则。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

益生菌probiotics

一类当摄入足够量时，可对生物体（人和动物）健康有益的活的菌类微生物。

[T/CIFST009-2022，3.1]

3.2

活菌密度viableprobioticdensity

被测样品单位质量或体积内可增殖（可培养）的益生菌活菌总数。

3.3

代谢活力metabolicactivity

活细胞原位代谢活动的强度。为细胞原位代谢状态的一项指标。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CDR：碳-氘键峰值占比（C-Dratios）；

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）；

MRS培养基：乳酸细菌培养基（ManRogosaSharpeMedium）；

MAL：代谢活力水平（MetabolicActivityLevel）；

MAL-HI：代谢活力异质性指数（MetabolicActivityLevelHeterogeneityIndex）；

PDMS：聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane）。

5检测原理

利用重水（D2O）同位素标记时，具有代谢活力的细胞会同化氘（D）并代替氢（H）进行合成代谢，

使得细菌的脂类、蛋白质、DNA等生物质被氘化，所产生新的C-D键可被拉曼光谱灵敏检测到，并且碳-氘（C-D）峰强度可反映细胞的代谢活力。基于细胞的代谢活力来进行活菌计数，即具有代谢活力的细胞为活细胞。CDR为C-D键的峰值光谱强度除以C-D键和C-H键的峰值光谱强度之和，以量化C-H键中D的替代程度，即碳-氘峰值占比；所述C-D键的光谱强度是指在拉曼位移波数范围（2040-

2300）cm-1范围内的拉曼光谱强度；C-H键的光谱强度是指在拉曼位移波数范围（2800-3100）cm-1范围内的拉曼光谱强度。

6试剂和材料

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DB42/T××××—××××

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

6.1基础试剂

生理盐水（0.85%NaCl，无菌），重水（D2O）（纯度99.9%），三级水[GB/T6682，4.3]。

6.2培养基

按照菌种类型配制，或选用相应商品化培养基。

MRS培养基粉末。

6.3芯片

氟化钙（CaF2）芯片（26mm×76mm），用于人工检测。

微流控计数芯片，带有高度为100μm的腔室。用于自动化检测的细菌计数。

微流控洗脱芯片，芯片由带有微结构的PDMS层与石英玻璃层组成，其中PDMS层的主要功能结构包括：1000个约0.3nL的微腔室，以及与其相连接的微通道。该芯片用于益生菌悬液的洗脱（主要指去除悬液中的培养基、D2O等物质），及用于拉曼检测的样品干燥制片（主要指将洗脱后的益生菌单细胞干燥于石英玻璃基底表面，用于后续拉曼成像）。用于自动化检测的样品洗脱和检测。

7仪器设备

7.1显微拉曼光谱仪：光谱分辨率不低于5cm-1，拉曼位移波数范围至少包含400cm-1-3200cm-1。需配备50倍物镜、100倍物镜。

7.2恒温培养箱：温控范围包含36℃,波动±1℃;

7.3振荡重悬器：转速覆盖1000-2800r/min；

7.4分析天平：感量0.1mg和0.01g；

7.5离心机：最大转速不低于5000r/min，有2-8℃制冷功能；

7.6显微镜：数值孔径（50倍物镜为0.5、100倍物镜为0.9），视场数26.5；

7.7真空进样装置（适用于自动化检测法）：真空度50mbar；

7.8注射泵（适用于自动化检测法）：流速范围包含2