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2024-01-27

外源基因在酵母中的表达

目

录

引言

外源基因克隆与构建

酵母转化与筛选

外源基因在酵母中表达分析

影响外源基因在酵母中表达因素探讨

外源基因在酵母中表达应用实例

总结与展望

引言

01

利用酵母表达外源基因的目的

酵母作为一种真核生物，具有较为完善的基因表达调控机制和蛋白质加工修饰系统，因此常被用作外源基因的表达宿主，以生产重组蛋白质或研究基因功能。

酵母表达系统的背景

自20世纪80年代以来，酵母表达系统逐渐发展成为一种重要的基因工程工具。随着分子生物学和遗传工程技术的不断发展，酵母表达系统的应用范围和效率不断提高。

酵母表达系统的组成

酵母表达系统主要由酵母宿主细胞、表达载体和转化方法三部分组成。其中，酵母宿主细胞常选用酿酒酵母或裂殖酵母等；表达载体则需包含外源基因、启动子、终止子等元件；转化方法则包括化学转化、电转化和基因枪等方法。

酵母表达系统的优点

酵母表达系统具有真核生物蛋白质翻译后加工修饰的能力，能够正确折叠和修饰外源蛋白质；同时，酵母生长迅速、培养条件简单、遗传背景清晰，便于进行基因操作和筛选。

酵母表达系统的应用

酵母表达系统广泛应用于生产重组蛋白质、研究基因功能和蛋白质相互作用等领域。例如，利用酵母表达系统生产人类胰岛素、干扰素等生物药物；研究基因转录、翻译和蛋白质修饰等过程的调控机制；筛选药物靶标和开发新药物等。

外源基因克隆与构建

02

03

基因特性

分析目的基因的特性，如编码蛋白质的氨基酸序列、功能域、表达调控元件等，以便设计合适的克隆策略。

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目的基因

根据研究目标，选择需要表达的外源基因，可以是来自其他生物体的基因，也可以是人工合成的基因。

02

基因序列

获取目的基因的核苷酸序列，可以通过数据库检索或基因合成服务获得。

载体选择

根据酵母表达系统的要求，选择合适的克隆载体，如酵母整合型载体或酵母附加型载体。

载体构建

在克隆载体中插入目的基因，可以通过限制性内切酶消化和连接酶连接的方法，或者利用同源重组技术实现。

表达调控元件

在克隆载体中加入适当的表达调控元件，如启动子、终止子、增强子等，以优化外源基因在酵母中的表达。

重组质粒鉴定

提取酵母细胞中的重组质粒，进行PCR扩增、测序等实验验证目的基因的正确插入。

质粒纯化

对验证正确的重组质粒进行大量扩增和纯化，以获得足够的质粒用于后续的酵母转化和表达实验。

重组质粒筛选

通过转化实验将重组质粒导入酵母细胞，利用选择性培养基筛选含有重组质粒的酵母细胞。

酵母转化与筛选

03

酵母感受态制备

选择对数生长期的酵母细胞，通过特定的处理方法（如LiAc/SScarrierDNA/PEG方法）使其处于易于接受外源DNA的状态。

转化方法

将目的基因与酵母表达载体连接，构建成重组质粒。然后将重组质粒转化入酵母感受态细胞中，通过热激或电击等方法促进重组质粒进入酵母细胞。

筛选方法

利用选择性培养基（如缺失特定营养物质的培养基）筛选转化子。只有成功整合了重组质粒的酵母细胞才能在选择性培养基上生长。

鉴定方法

通过PCR、Southernblot等方法对转化子进行鉴定，确认目的基因已经成功整合到酵母基因组中。

将鉴定为阳性的酵母克隆接种到含有甘油的培养基中，于-80℃超低温冰箱中保存。

保存方法

从保存的甘油菌中接种少量菌液到新鲜培养基中，进行扩大培养。根据实验需求，可选择不同的培养基和培养条件进行培养。

扩大培养

外源基因在酵母中表达分析

04

通过SDS电泳分离表达产物，利用特异性抗体进行Westernblot检测，可确定表达产物的分子量和免疫原性。

酶活性测定

对于具有酶活性的表达产物，可通过测定其催化底物反应的速率来检测表达产物的酶活性。

荧光定量PCR

利用荧光定量PCR技术，通过特异性引物扩增目的基因，实时监测PCR产物量的变化，可快速、灵敏地检测表达产物的mRNA水平。

SDS电泳

通过比较表达产物与已知标准品的性质，如分子量、免疫原性、酶活性等，对表达产物进行定性分析。

定性分析

利用标准曲线法、内标法等方法，对表达产物进行定量分析，确定其表达量。

定量分析

通过蛋白质组学技术，如二维凝胶电泳、质谱分析等，对表达产物进行全面、系统的定性和定量分析。

蛋白质组学分析

01

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03

利用酵母表达系统高通量筛选和评估药物对表达产物的活性影响，为药物研发提供有力支持。

药物筛选和评估

对于具有生物活性的表达产物，如激素、生长因子等，可通过细胞培养、动物实验等方法测定其生物活性。

生物活性测定

对于具有酶活性的表达产物，可通过测定其催化底物反应的速率和效率来评估其酶活性。同时，还可利用酶抑制剂或激活剂来研究表达产物的酶活性调控机制。

酶活性测定

影响外源基因在酵母中表达因素探讨

05

组成型启动子

在所有细胞类型