质粒提取的原理及步骤.docVIP

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和?SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性?而呈絮状，离心时可沉淀下来。

一、试剂准备

1.?溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。1M?Tris-HCl[t1]?(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10lbf/in2高压灭菌15min?，贮存于4℃。

溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0

葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去

2.?溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS。2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2]?。

这是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱?性。很多人不知道