第二课-碱裂解法小量提取质粒DNA.ppt

第二课碱裂解法小量提取质粒DNA碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从5kb到400kb不等。质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。实验原理溶液I:GTE50mM葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，并抑制微生物生长。实验原理溶液II:NaOH/SDS溶液0.2NNaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。由于质粒和细菌基因组DNA的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂。因此，在裂解细菌时要注意：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂；第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。1%SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。实验原理溶液III：醋酸钾溶液，Ph4.8当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但细菌染色体DNA则难以复性。SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀可将绝大部分蛋白质沉淀。同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中。实验原理酚/氯仿抽提通过酚、氯仿抽提可以去除残留的蛋白质。酚和氯仿都是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大于氯仿。由于酚能溶解10%-15%的水，因此在使用前要用Tris溶液（pH8.0）饱和。以免减少抽提过程中DNA溶液的损失。水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿比重较大且和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。由于酚与水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后会有少量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。实验原理乙醇沉淀DNA回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，乙醇可以消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最常用的盐是醋酸铵／氯化锂／氯化钠／醋酸钠。沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到－20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀。为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。实验原理DNA的溶解DNA沉淀经过70%的乙醇洗涤后，在实验台上敞口放置一定时间，使残余乙醇挥发掉。当DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用适当缓冲液溶解便可溶得快速而且完全。完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且效率较低。得到的质粒样品一般用含RNaseA（20ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。实验步骤取1.5ml过夜培养菌置于1.5ml离心管中，于微量离心机上以12000rpm离心1min。弃上清液。重复步骤1、2。短暂离心后，尽量去除上清液。沉淀中加100μl溶液I，充分悬浮沉淀（用移液体器吹打悬浮或剧烈振荡）。加入200μl溶液II(新鲜配置)，加盖后缓慢颠倒离心管6次混匀（千万不要振荡），置于冰浴2-3min。加入150μl预冷溶液III，缓慢颠倒6次混匀，置于冰浴5min。微量离心机上，12000rpm离心10min。将上清液转移到另一新的1.5ml离心管中。10.加入5ulRNaseA,37℃保温30min;11.加入等体积酚/氯仿（1