番茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法.docx

前言

番茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法

SN/T2596—2010

样要求参见SN/T1809),加150ml.预冷的0.05mol/L..pH7.2的磷酸-吐温缓冲液(PBT)。摇匀使种子完全湿润，在室温真空条件下孵育30min~60min,慢慢恢复常压；或在4℃下磁力搅拌器上搅24h~48h.取50mL.样品抽提液，12000g离心10min浓缩，弃上清液，加入1mL.0.01mol/L.磷酸缓冲液(pH7.2)重新悬浮，悬浮液进行DAS-ELISA检测。

6.3双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)

具体检测步骤及判定方法见附录C。若检测结果为阳性，进行6.3及后续操作；若检测结果为阴

性，可判定供试样品为阴性。

6.4病菌的分离

取6,1中番茄种子抽提液进行系列浓度稀释，稀释倍数分别为10倍，100倍，1000倍，10000倍；将各浓度稀释液在KB培养基平皿上进行涂布，50μl/平皿，每个浓度至少涂三个平皿，28℃培养48h。

根据附录A中病菌在KB培养基上的菌落特征，挑取可疑的单菌落，连续转接2次进行纯化。对纯化的可疑菌株进行6.5步骤操作。

6.5PCR方法

具体实验步骤和试剂配制见附录D。采用特异性引物Pl/P2对可疑菌林进行PCR检测，以番茄细菌性叶斑病菌标准菌株作阳性对照，以非番茄细菌性叶斑病菌的植物病原细菌作阴性对照，以水作空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。若可疑菌株与阳性对照在650bp处有条带，阴性对照与空白对照无条带出现，可判定检测结果为阳性。

7结果判定

在血清学检测中，若ELISA法检测结果为阳性，可初步判定为检出番茄细菌性叶斑病菌。

所分离的细菌菌株菌落特征与描建相符，FCR检测结果为阳性，可最终判定为检出番茄组菌性叶斑病菌。

8菌株保存

分离并最终鉴定为番茄细菌性叶班病菌的菌株应转接到KB培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃左右低温冰箱中保存，30d~60d转接一次，以防止病菌死亡，以备复核、谈判和仲裁。必要时将菌株冻干后长期保存。

9复核

必要时由专家对检测结果进行复核。

SN/T2596—2010

附录A

(资料性附录)

番茄细菌性叶斑病菌(Fsendomunasspriagaepv,fomatu)相关资料

A.1英文名

Bacterialspeckoftomatoplants

A.2学名

Psrhdomomassyringarpv,tomato

A.3分布

埃及，摩洛哥，南非，印度，以色列，日本，约旦，土耳其，澳大利亚，新西兰，奥地利，保加利重，捷克，斯洛伐克，丹麦，法国，德国，希腊，匈牙利，意大利，波兰，葡萄牙，罗马尼亚，俄罗斯，西班牙，瑞士，前南斯拉夫，加章大，美国，巴西，委内瑞拉，中国(黑龙江，吉林，辽宁，天津，台湾)。

A.4分类地位及生物学特性

番茄细菌性叶斑病菌菌属原核生物界(Procnryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),假单抱菌科(Pseudo-

monaceae),假单孢菌属(Pscardomanas)。单胞，杆状，直或微弯，革兰氏阴性，极鞭单生或多生，能运

动，无荚膜，无芽孢，一般大小(0.5μm~1.0gm)×(1.5gm~5.0μm)。番茄细菌性叶斑病菌在KB

培养基上菌落特征为圆形、白色、表面光滑，不透明，48h培养菌落直径在2mm～3mm,有黄绿色

荧光。

A.5寄主范围

番茄(I.yvopersiconesxwlewtrm),辣椒(Capsicwaaanwwm),茄子(SplarumedongenaL.).龙葵

(.SwlanwaenigruaLimn.)、曼佗罗(DatarastrawoniumtL.,)。

A.6危害症状

番茄细菌性叶斑病也称番茄细菌性斑疹病，主要侵染番茄茎干、叶片和果实。苗期和成株期均可染病，以叶缘及未成熟果实最明显。苗期发病就有症状表现，叶片最先感病，基和花后感病。叶片初染病，产生水渍状小圆点，扩大后病斑暗褐色，近圆形或不规则斑点，直径1mm～2