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细胞培养流程及注意事项

COOK

CELL

一、细胞培养概念

细胞培养（cellculture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜

温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主

要结构和功能的一种方法。

细胞培养可分为原代培养和传代培养；直接从体内获取的组织细

胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，

则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他

比率转移到另一个或几个容器（同样底面积的容器）中扩大培养，为

传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

二、细胞复苏

1、

细胞复苏遵循“慢冻快融”的原则，所以细胞冻存管从液氮中取

出后，稍等待液氮挥发后，将冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动融化

（约1min）

2、

吸取细胞混悬液加入离心管，800rpm离心3min，弃去上清

3、

加入对应细胞的完全培养基，重悬细胞，再以5x105个/ml细胞接

种至培养瓶/培养皿中

4、

放入37℃培养箱中，CO5%培养，定时观察细胞培养情况

2

三、细胞冻存

1、

悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清

2、

贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇

晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，

轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃

孵育2-3min（对于新培养的细胞，建议消化时每隔30s镜下观察消化

情况，以确定合适的消化时间），加入含血清完全培养基终止消化，

用移液器吸取瓶内液体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重

复2-3次，将细胞悬液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清

3、

加入冻存液：加入细胞冻存液（最好是用10%DMSO完全培养

基冻存细胞）重悬细胞，使细胞浓度在（5～10)×105个/ml，然后分

装到冻存管中

4、

程序降温盒：4℃放30min→-80℃过夜（至少4-8h）→液氮

（长期保存）

5、

温馨提醒：

4℃30min这个步骤一定不能省略，否则冻存液无法渗透到细胞，

易产生冰晶导致细胞受损；细胞-80℃保存不要超过一个月，长期保存

要放在液氮中，保持细胞活性

赛库生物的细胞每一个批次都会进行一次支原体和STR检测

四、细胞传代

1、

悬浮细胞：吸取细胞悬液，800rpm离心3min，弃掉上清，加入

新鲜的含血清的完全培养基，用吸头小心重悬细胞，按细胞生长密度

将细胞悬液均匀分配到培养容器中进行传代培养

2、

贴壁细胞：用移液管或者巴氏吸管吸取培养液，加入PBS轻轻摇

晃培养瓶/培养皿数次，冲洗细胞，然后吸取丢弃PBS，加入胰酶消化，

轻轻摇晃培养瓶/培养皿数次，使胰酶与细胞表面充分接触，放到37℃

孵育2-3min，加入含血清完全培养基终止消化，用移液器吸取瓶内液

体轻轻冲洗容器表面，使细胞流入容器底部，重复2-3次，将细胞悬

液移到离心管中，800rpm离心3min，弃去上清，加入新的含血清完

全培养液重悬成单细胞悬液，按细胞生长密度将细胞悬液均匀分配到

培养容器中进行传代培养

3、

将培养容器放到37℃孵育，第二天显微镜