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关于连接反应的心得

关于连接反应的心得

关于连接反应的心得

最近我在进行转基因载体构建，其中关键步骤包括酶切、酶切片

段回收、载体与外源基因A的连接、转化以及重组子的鉴定。我的工

作首先是将基因A（5kb）连接到表达载体B（22kb），然后还要将标

记基因（6-8kb）连到带A的载体上，这其中包括粘末端连接、平端

连接、同尾（相同粘性突出端）连接以及双酶切定向连接。但是我在

进行A和B连接时废了1个多月，经高人指点后才连接成功，之后几

步连接也相当顺利，经过无数次失败后终于成功，欣喜之余将一点实

验心得写下来，供大家参考。

1．关于不同连接方式的效率：

根据载体自连的可能性大小，可以总结出不同连接方式的效率高

低，双酶切定向连接粘末端连接=同尾连接平端连接。如果将载体

双酶切后的非目的片段去除干净，定向连接将很难自连，而平端连接

最容易造成载体自连

2．关于载体和insert的酶切处理：

这是连接反应中最关键的问题之一。我做的第一步连接失败的原