DNA提取步骤中文版.pdf

一DNA的抽提QIAGEN试剂盒。1标记1.5mlEP管吸取20ul蛋白酶K加入1.5mlEP管

底部。2加入200ul血清至1.5mlEP管。若血清不足200ul可加适量PBS补充。余血清

-20℃保存3加200ul缓冲液AL至样品管震荡混匀15s。456℃孵育10min。5稍微

离心将EP管壁上的液体离心下去。6加200ul无水乙醇至样品管中震荡混匀15s稍微

离心。7混合液转移至QIAamp螺旋住置于2ml收集管上小心勿沾湿边缘。加样器

垂直于螺旋住将混合液慢慢加至滤膜中间。关盖标记8000rpm离心1min。再将

QIAamp螺旋住转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。8打开QIAamp

螺旋柱加入500ul缓冲液AW1勿沾湿边缘。关盖8000rmp离心1min。再将QIAamp柱

转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。9打开QIAamp柱加入500ul缓

冲液AW2勿沾湿边缘。关盖全速12000rpm离心3min。10标记1.5ml离心管将

QIAamp柱置于一个清洁的1.5mlEP管弃含滤液的收集管。打开QIAamp柱加入50ul

缓冲液AE。室温孵育3min。12000rpm离心1min。继续下一步实验操作或-20℃保存。

二目的片段的扩增第一轮PCR反应体系30ul要有一个阳性对照和一个阴性对照n

个标本10×Buffer3nuldNTP200ul/ml3nulprimer上游引物0.3nul下游引物0.3n

ulTaq酶0.5nulH2O20nul模板DNA3ul反应条件94℃1min94℃20sec55℃

20sec72℃1min20sec反应35个循环注意配体系时先配总反应体系混匀分装后再

加标本一管一枪头。防止污染。配置体系要在超净台内操作。4.第二轮PCR反应

体系50ul取第一轮PCR产物另加一空白管做阴性对照即有二个阴性对照若出现污染

可以据此判断是那一轮PCR污染。10×Buffer5nuldNTP200ul/ml5nulprimer上游

引物0.3nul下游引物0.3nulTaq酶1nulH2O37nul模板DNA2ul反应条件

94℃1min94℃20sec55℃20sec72℃40sec共反应35个循环三电泳1.制备琼脂

糖凝胶一般配置浓度为1根据扩增片段的长度而定。1适量琼脂糖适量1×TAE液总

体积不要超过三角烧瓶的1/2以1/3较好。微波炉加热至溶液变透明。2取出三角瓶

适当降温后加入EB溴化乙啶混匀。轻倒入槽防止产生气泡。厚度一般为0.3-0.5cm。

槽内梳子梳齿多少按自己需要而定。2.凝胶凝固后小心取出梳子勿将孔底拉破。3.

将凝胶放入电泳槽内电泳槽中的电泳缓冲液要没过凝胶约1mm。4.取含适量溴酚蓝

的电泳载样液在板上着点不要太多每点混入第二轮PCR产物3ul混匀后垂直加入琼

脂糖胶孔内5.低压电泳观察溴芬蓝的移动位置以适时停止电泳。6.紫外线成像仪内

看胶。四胶回收TIANGEN试剂盒严格按照说明书操作操作步骤第一次使用前应

按照试剂瓶标签的说明先在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇所有离心步骤

均为使用台式离心机在室温下离心。1.柱平衡步骤向吸附柱CA1中吸附柱放入收

集管中加入500μl平衡液BL12000rpm13400×g离心1分钟倒掉收集管中的废液将

吸附柱重新放回收集管中。2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下尽量切

除多余部分放入干净的离心管中称取重量。3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN当

回收的目的片段2时建议使用6倍体积溶胶液PN如凝胶重为0.1g其体积可视为100

μl依此类推。50℃水浴放置10分钟其间不断温和地上下翻转离心管以确保胶块充分

溶解。如果还有未溶的胶块可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全