天津大学《生物技术》课件-杂交技术 .docxVIP

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核酸分子杂交检测法

·核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法。

·变性(Definition)和变性因素：Tm

·复性(退火):

·核酸杂交：利用两条不同来源的多核苷酸链(DNAorRNA)之间的互补性而使它们形成异源双链。

变性

复性

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Nucleic-acidprobe

√核酸探针：一段与目的基因互补的核酸序列，用它与待测样品(例如目的DNA)进行核酸分子杂交(一小部分),可以判断两者的同源程度。又称“寡核苷酸探针”

√单链

√标记(如放射性同位素、生物素等)

目的：为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，即显示出与核酸探针具有同源性序列的精确位置，从而判断阳性菌落的位置，靶核酸在细胞中的位置(原位杂交),或特异性片断的大小(转移印迹杂

交)等。

Principles

吕

吕

TargetDNA

(Mixtureofdifferent

Denature

Mixandallowtoreanneal

黑

ProbeDNA

(Usuallyhomogeneous

andlabelěd)

229

1t?t

Reannealedtarget

DNA

Key

Label

ReannealedDNA

DNAfragments)

Probe-target

heteroduplexes

probe

杂交的双方是待测核酸及探针4

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Procedureofhybridization

√分子杂交技术为了从分子水平鉴定目的基因是否已经整合到受体细胞中、是否转录、是否表达。即用已知的基因片段(往往是目的基因片段)制作的探针与待测样品的基因片段进行核酸分子杂交，从而判断二者的同源程度。

√包括：原位杂交、菌落(噬菌斑)杂交、

DNA印迹法(Southernblotting)

Northernblotting、Westernblotting

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Southernblotting

·ProposedbyDr.EdwinSoutherninEdinburgh

Universityin1975.

·Majorsteps:

-electrophoresis

-transferblotting

-molecularhybridization

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首先将DNA用限制性内切酶水解成一系列片段，然后进

行琼脂糖凝胶电泳，不同大小的DNA片段经电泳彼此分开，

碱溶液中使DNA变性，毛细管作用下再将分开的DNA片段从凝

胶经过变性转印到硝酸纤维滤膜上，最后用标记的探针DNA

(RNA)与膜上的DNA片段杂交，自显影定位，从而检测出各

个DNA片段与探针之间有无同源序列。

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Nitrocellulose

Nitrocellulosefilter

三

Alkalinesolution

Hybridize

probe

Autoradiogram

检测杂交信号

Gelelectrophoresis

Filter

paper

Sponge

限制性内切酶酶切

提取DNA

Nitrocellulose

with

el

具体步骤：

(一)待测核酸样品的制备

裂解或破碎细胞、抽取纯化基因组DNA、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段

(二)待测DNA样品的电泳分离

琼脂糖凝胶电泳分离，大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶；凝胶具有分子筛效应

(三)凝胶中核酸的变性(碱)

凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,甲酰胺

变性剂可干扰碱基堆积力和氢链的形成

(四)Southern印迹

(五)Southern杂交

(六)杂交结果检测9

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印迹：

将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，转移后的核酸

片段将保持其原来的相对位置不变。

√固相支持物的选择：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜

√转移方法：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法

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毛细管虹吸印迹法：

利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。

基本原理：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaC1和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而

滞留在膜上

重物(250~500g)

玻璃板.

吸水纸

湿滤纸

硝酸纤维素膜

或尼龙膜

.湿滤纸湿滤纸桥

.湿滤纸

湿滤纸桥

玻璃容器

转移缓冲液(20×SSC)支