16 高效液相色谱法 (全).ppt

五、洗脱方式（一）恒定组成溶剂洗脱采用恒定组成及配比的混合溶剂洗脱，是最常用的色谱洗脱方式。操作简便、柱易再生。对于成分复杂的样品往往难以获得理想的分离结果。（二）梯度洗脱是指在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比或pH而进行的洗脱方法。用于分析组分数目多、组分k值差异较小的复杂样品，以缩短分析时间、提高分离效、改善色谱峰形、提高检测灵敏度。有时会引起基线漂移，重现性不好。*基本原理一、速率理论（一）涡流扩散项是因组分分子在色谱柱中运动路径不同而引起的扩散导致色谱峰扩展。为了减小A，一是采用小粒度固定相，减少颗粒直径，二是采用球形、粒度分布小的固定相，并用匀浆法装柱，减小填充因子。（二）纵向扩散项是因组分分子本身的运动所引起的纵向扩散而使色谱峰扩展。因为液体的黏度比气体大很多，而且高效液相色谱法的流动相流速通常是最佳流速的3~5倍。故此项对色谱峰扩展的影响可以忽略不计。（三）传质阻力项C由于组分分子在两相间的传质过程中不能瞬间达到平衡而引起，从而使色谱峰扩张，其含义与气相色谱法完全相同。则高效液相色谱法中的速率方程可以简写为二、柱外展宽产生：柱外死体积引起的色谱峰展宽影响：柱外死体积解决：各部件接头采用“零死体积接头”管道对接呈流线型检测器流通池采用尽可能小的池体积一、高效液相色谱仪的基本结构高效液相色谱仪的组成：高压输液泵进样器色谱柱检测器色谱工作站二、高压泵和梯度洗脱装置（一）高压输液泵液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。（二）梯度洗脱装置高压梯度：由两个输液泵分别各吸入一种溶剂，加压后再混合，混合比由两个泵的速度决定。低压梯度：用比例阀将多种溶剂按比例混合后，再由输液泵加压输送至色谱柱。三、进样器六通进样阀四、色谱柱色谱柱：是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。保护柱：是接在分析柱前端的装有与分析柱相同固定相的短柱（5nm～20nm），可以经常更换。五、检测器用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外检测器荧光检测器示差折光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器（一）紫外检测器浓度型检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。（二）荧光检测器许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。特点：具有高的灵敏度和选择性的浓度型检测器，灵敏度要比紫外检测法高2?3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。（三）示差折光检测器利用样品池和参比池之间折光率的差别而对组分进行检测，测得折光率差值与组分浓度成正比。缺点：折光率受温度影响较大，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱。（四）电化学检测器利用组分在氧化还原过程中产生的电流或电压变化而对样品进行检测。特点：只适用于测定具有氧化还原活性的物质，灵敏度较高。（五）蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。不适于挥发性物质，特别适于梯度洗脱。一、速率理论基本原理（一）涡流扩散项是因组分分子在色谱柱中运动路径不同而引起的扩散导致色谱峰扩展。为了减小A，一是采用小粒度固定相，减少颗粒直径，二是采用球形、粒度分布小的固定相，并用匀浆法装柱，减小填充因子。（二）纵向扩散项是因组分分子本身的运动所引起的纵向扩散而使色谱峰扩展。因为液体的黏度比气体大很多，而且高效液相色谱法的流动相流速通常是最佳流速的3~5倍。故此项对色谱峰扩展的影响可以忽略不计。基本原理由于组分分子在两相间的传质过程中不能瞬间达到平衡而引起，从而使色谱峰扩张，其含义与气相色谱法完全相同。则高效液相色谱法中的速率方程可以简写为：（三）传质阻力项C基本原理产生：柱外死体积引起的色谱峰展宽影响：柱外死体积解决：各部件接头采用“零死体积接头”管道对接呈流线型检测器流通池采用尽可能小的池体积基本原理二、柱外展宽分析化学高效液相色谱仪基础化学教研室王蕾蕾高效液相色谱仪高效液相色谱仪的组成：高压输液泵进样器色谱柱检测器色谱工作站一、高效液相色谱仪的基本