实验四-纸层析.ppt

实验六纸层析鉴定

转氨基作用层析是利用不同物质，不同的理化性质如吸附力、分子形状、大小、极性、分配系数的不同而建立起来的技术。所有层析系统都有两相组成。既固定相和流动相。固定相既固体物质或是固定于固体物质上的成分。流动相既可以流动的物质如：水或溶液等。混合物要经过此两相与其作用，最后分离。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，吸收20~22%的水。而且其中6~7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有一定的迁移率。丙氨酸属于非极性中性氨基酸，易溶于有机溶剂，而谷氨酸属于极性酸性氨基酸，易溶于水，因此在纸层析体系中谷氨酸和丙氨酸相比而言，丙氨酸更易溶于流动相，因此迁移距离远。本实验用圆盘滤纸进行水平型层析，层析结束后利用氨基酸与茚三酮共加热，生成蓝紫色化合物的茚三酮法显色，观察色斑，判定结果。【操作】1、肝匀浆的制备：新鲜的动物肝脏1g，在研钵中用剪刀剪碎，加入9ml冰冷的0.01MpH7.4磷酸缓冲液迅速研成匀浆。（已经制备好，直接取用）2、保温：取干燥小试管（或离心管））二支，分别标明测定管与对照管，按下表操作：

试剂测定管对照管肝匀浆0.5ml0.5ml（置37℃水浴保温5min）（置沸水浴5min）0.1M丙氨酸0.5ml0.5ml0.1Mα-酮戊二酸0.5ml0.5ml0.01MpH7.4磷酸缓冲液1.5ml1.5ml3、层析：取直径10cm圆形滤纸一张，用圆规半径1cm同心圆，通过圆心作相互垂直的线，然后半径每次增加0.5cm画同心圆至滤纸边缘。在滤纸圆心处打一孔（如铅笔芯大小）另取同类滤纸约1cm，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，插入小孔，（勿使突出滤纸面）。将层析液放入干燥表面皿中，并将表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤纸平放在培养皿中，灯芯浸入溶剂中，将另一个培养皿反盖上，可见溶剂沿芯上升到滤纸，再向四周扩展，约25分钟后晕染的边缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅笔标记层析液前沿，用吹风机吹干。4、显色：将上诉滤纸平放在培养皿中，用喷雾器喷上0.5%茚三酮溶液用热风吹，此时可见紫色的同心圆斑出现，比较色斑的位置和色泽的深浅，分析实验结果。5、【计算】分别计算各图谱的Rf值。**本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现以证明转氨基作用。充分混匀，置37℃水浴保温45分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中5min以终止反应。