血清球蛋白的分离纯化与鉴定.pptVIP

关于血清球蛋白的分离纯化与鉴定一、目的和要求学习盐析法分离血清蛋白的原理和技术掌握凝胶过滤层析法脱盐的基本操作技术掌握用醋酸纤维膜电泳法分离血清蛋白的原理及方法第2页,共27页，2024年2月25日，星期天二、原理（一）盐析1.概念和原理盐析是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。蛋白质在纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”(saltin)。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”(saltout)。第3页,共27页，2024年2月25日，星期天“盐析”破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来表面电荷水化膜第4页,共27页，2024年2月25日，星期天2.常用中性盐：盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是硫酸铵。硫酸铵的优点1.在水中化学性质稳定，2.溶解度大，3.溶解度的温度系数变化较小，4.硫酸铵价廉易得，分离效果好，5.性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。第5页,共27页，2024年2月25日，星期天3.盐浓度计算各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度各异，所需的最小盐量称做盐析浓度。A，GAG↓半饱和(NH4)2SO4饱和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分离按体积：12（50%）；14（25%）第6页,共27页，2024年2月25日，星期天(1)饱和硫酸铵溶液法将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1按体积：12（50%）；14（25%）(2)固体硫酸铵法可采用直接加入固体硫酸铵的方法。硫酸铵饱和度的计算第7页,共27页，2024年2月25日，星期天离心力(F)等于被离心的物体质量与向心加速度的乘积向心加速度=4π2V2r（其中V为每秒的转数，r为离心半径，单位cm）F=m4π2V2r相对向心加速度=4π2V2rg多少个g（二）离心(centrifugation)----分离1.离心力第8页,共27页，2024年2月25日，星期天2.离心机分类根据离心机的转数分类可以分为三类①5000rpm普通离心机②5,000-25,000rpm高速离心机③25,000-10,000rpm超速离心机因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有制冷装置超速离心机不但有制冷装置，而且离心室密封真空第9页,共27页，2024年2月25日，星期天3.离心机的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平在对称位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor第10页,共27页，2024年2月25日，星期天三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入饱和(NH4)2SO42ml2→6ml33%弃上清，2mlPBS+1ml饱和(NH4)2SO41→3ml33%弃上清，1mlPBS+0.5ml饱和(NH4)2SO40.5→1.5ml33%弃上清，洗涤0.5mlPBS溶解↓摇匀↓混匀静置30min，离心3000rpm10min↓↓混匀静置30min，离心3000rpm10min↓混匀静置30min，离心3000rpm10min第11页,共27页，2024年2月25日，星期天层析利用物质在固定相（stationaryphase）与流动相（mobilephase）之间不同的分配比例，达到分离待测物质的技术。(三)层析(chromatography)---纯化凝胶过滤层析法（gelfiltrationchromatography）离子交换层析法（i