蛋白质工程及应用.pptVIP

1985年Wells提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。盒式突变技术第59页,共72页，2024年2月25日，星期天二、蛋白质分子的高级改造（结构域的拼接）研究证明，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域结构域由α螺旋、β折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规则构成的三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一种基本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。第60页,共72页，2024年2月25日，星期天三、全新蛋白质的设计与构建上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变它的结构，以期达到改变其性质的目的。如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，则需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。第61页,共72页，2024年2月25日，星期天蛋白质工程在食品工业中的应用蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面：①延长酶的半衰期；②提高酶的热稳定性；③延长药用蛋白的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。第62页,共72页，2024年2月25日，星期天一、?消除酶的被抑制特性1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的甲硫氨酸，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用半胱氨酸代替甲硫氨酸的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。第63页,共72页，2024年2月25日，星期天二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因而能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。第64页,共72页，2024年2月25日，星期天在高温下天冬酰胺和谷氨酰胺容易脱氨形成天冬氨酸和谷氨酸，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个天冬酰胺，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个天冬酰胺分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性第65页,共72页，2024年2月25日，星期天四、?改变酶的最适pH值条件葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80℃稳定，而在碱性条件下，80℃时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60℃进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu谷或Asp天冬)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg精或Lys赖)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应第66页,共72页，2024年2月25日，星期天五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。第67页,共72页，2024年2月25日，星期天六、修饰酶的催化特异性利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解α-1，4糖苷键和α-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变第68页,共72页，2024年2月25日，星期天改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。Nisin分子