猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制的开题报告.docxVIP

猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制的开题报告

一、研究背景及意义

猪传染性胃肠炎（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒引起的急性胃肠炎症，导致猪崭泻、呕吐、消瘦，尤其是对幼猪的危害更为严重，经常造成大量的猪只死亡。2013年至2014年PED在中国迅速传播，给我国畜牧业和经济带来了严重的损失。因此，如何及早发现PED的感染情况，对于保障养猪业生产、实现养猪业的可持续发展具有重要意义。

目前，PED的诊断主要以病原学检测为基础，包括病毒抗体检测和核酸检测。PCR、实时荧光PCR、细胞培养和酶联免疫吸附试验等被广泛用于PED的检测，但由于这些方法需要高昂的设备和专业人员，不利于现场快速诊断，因此需要开发一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法。

现有的研究表明，利用胶体金技术和免疫层析技术结合，可以制备出一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法，包括PED胶体金免疫层析试纸条。这种试纸条不需要显微镜观察，只需要通过肉眼观察检测结果即可，能够满足现场检测的需求。因此，本研究拟开发PED胶体金免疫层析试纸条，以期提高PED的诊断水平，为养猪业提供更好的保障。

二、研究内容及方法

1.PED病毒抗原的克隆和表达：

通过PCR扩增PED病毒N基因，并将其克隆到表达载体pET28a(+)中，利用大肠杆菌表达PED病毒N基因。采用亲和层析和SDS等方法提取纯化重组蛋白；

2.PED胶体金免疫层析试纸条的研制：

将制备的PED病毒N蛋白标记在胶体金颗粒表面，制备PED胶体金。将制备的PED胶体金涂覆在膜的测试线位，根据PED病毒N蛋白的特异性，将抗PED病毒的单克隆抗体固定在纸条的测试线位上。同时，将抗鸡IgG的单克隆抗体固定在控制线位上。制备PED胶体金免疫层析试纸条。

3.PED胶体金免疫层析试纸条的性能评价：

测量PED胶体金免疫层析试纸条的检测限、特异性和灵敏度；通过实验比较PED胶体金免疫层析试纸条和PCR、实时荧光PCR等方法的检测结果并进行统计学分析，评价PED胶体金免疫层析试纸条的准确度、去假阳性率和去假阴性率等。

三、预期结果

1.成功克隆和表达PED病毒N基因，制备出PED病毒N蛋白；

2.研发出PED胶体金免疫层析试纸条，在性能评价中取得较好的检测限、特异性和灵敏度；

3.通过与PCR、实时荧光PCR等方法比较，证明PED胶体金免疫层析试纸条具有较好的准确度、去假阳性率和去假阴性率；

4.为PED的快速诊断提供了一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的检测方法，为我国的养猪业提供更好的保障。

四、研究经费

本研究的经费主要用于病毒抗原克隆和表达、试纸制备、试纸性能评价以及试纸在PED检测中的应用等方面，总经费预计为XX万元。

五、研究时间

本研究的预计时间为XX个月。

六、研究人员及分工

1.分子生物学实验：X、X、X等；

2.免疫学实验：X、X、X等；

3.测定和数据分析：X、X等。

七、研究进度计划

1.第1-6个月：病毒抗原克隆和表达，制备出PED病毒N蛋白，并制备出PED胶体金；

2.第7-10个月：试纸制备，制备出PED胶体金免疫层析试纸条；

3.第11-14个月：性能评价，通过实验证明PED胶体金免疫层析试纸条的检测限、特异性和灵敏度；

4.第15个月：应用研究，对PED胶体金免疫层析试纸条进行应用研究；

5.第16个月：总结撰写本论文。