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ICS11.220

B41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T683—2003

犬传染性肝炎诊断技术

Diagnostictechniquesforinfectiouscaninehepatitis

2003-07-30发布

2003-10-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T683—2003

前言

本标准的附录A为规范性附录。

本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。

本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。

本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬、杨秀勇。

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NY/T683—2003

犬传染性肝炎诊断技术

1范围

本标准规定了犬传染性肝炎(ICH)的临床诊断、犬传染性肝炎病毒(ICHV)的分离与鉴定、酶联免疫吸附试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术。

本标准适用于犬传染性肝炎的诊断。

2临床诊断要点

2.1临床症状

最急性病例，患犬在呕吐、腹痛和腹泻等症状出现后数小时内死亡。急性型病例，患犬体温呈马鞍型升高，精神抑郁，食欲废绝，渴欲增加，呕吐，腹泻，粪中带血。亚急性病例，特征性症状是患犬角膜一过性混浊，即“蓝眼”病，有的出现溃疡。慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期，患犬多不死亡，可以自愈：

2.2病理变化

病犬主要表现全身性败血症变化。在实质器官、浆膜、粘膜上可见大小、数量不等的出血斑点。肝肿大，呈斑驳状，表面有纤维素附着。胆囊壁水肿增厚，灰白色，半透明，胆囊浆膜被覆纤维素性渗出物，胆囊的变化具有一定的诊断意义。

3病毒分离与鉴定

3.1材料准备

3.1.1试剂

3.1.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。

3.1.1.2犬肾传代细胞(MDCK细胞)。

3.1.1.3标准阳性血清：ICHV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024。

3.1.1.4标准阴性血清：无ICHV感染的犬血清。

3.1.1.5新生牛血清，青霉素，链霉素。

3.1.2器材

a)细胞培养瓶；

b)吸管；

c)二氧化碳培养箱；

d)37℃恒温水浴箱；

e)普通冰箱及低温冰箱；

f)离心机及离心管；

g)研磨器械；

h)普通光学显微镜；

i)微量加样器，容量5μL~50μL,50μL～200μL;

j)0.45μm微孔滤膜。

3.1.3样品

ICHV存在于病犬扁桃体、肝脏、脾脏等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min。取上清10000r/min离心20min,取上清用于ICHV分离。

2

NY/T683—2003

3.2操作方法

3.2.1细胞培养

用含8%新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养MDCK细胞。每3d～4d传代一次，细胞长

成单层时，用于ICHV分离。

3.2.2病料接种

将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCK细胞，37℃吸附1h,加入无血清DMEM继续培养3d~5d,观察结果。

3.2.3结果观察

ICHV感染MDCK细胞3d～5d表现为细胞增大变圆、变亮、折光性增强、聚集成葡萄串状。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为ICHV检测阴性。

3.2.4ICHV的鉴定

将出现细胞病变的细胞培养物，用1%人“O”型红细胞进行血凝试验，血凝试验阳性者，再用ICHV单克隆抗体进行血凝抑制试验，鉴定毒株。

4酶联免疫吸附试验

4.1材料准备

4.1.1试剂

4.1.1.1ELISA抗原包被板。

4.1.1.2标准阳性血清：用ICHV抗原免疫犬获得的血清。

4.1.1.3标准阴性血清：无ICHV感染的犬血清。

4.1.1.4酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗犬IgG。

4.1.1.5磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.2章。

4.1.1.6洗涤液：配制见第A.3章。

4.1.1.7样品稀释液：配制见第A.4章。

4.1.1.8底物溶液：配制见第A.6章。

4.1.1.9终止液：配制见第A.7章。

4.1.2器材

a)酶联检测仪；

b)