(58)--3.4.1 核酸的提纯、凝胶电泳.ppt

第三专题核酸化学*琼脂糖凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：基本原理：一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。电泳迁移率：用途：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图、蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来用EB，1ngDNA条带可显示**核酸的核苷酸序列测定四DNA聚合酶链反应(PCR)五第四节核酸的研究方法基因重组技术六核酸的分离、提纯和定量测定一核酸的超速离心二核酸的凝胶电泳三一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。**（一）DNA分离真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/LNaCl）。据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA在含0.3MNaAC-70%乙醇时沉淀。（二）RNA的分离RNase的灭活：玻璃器皿：140-200℃，8h塑料器皿：0.1%DEPC，37oC，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加Rnasin(核糖核酸酶抑制剂)等特异的RNase抑制剂★用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜1.33g/mlDNA：1.71g/ml左右RNA：＞1.89g/ml★mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法（三）核酸含量的测定方法核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260nm和280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。核酸浓度的测定：紫外分光光度法、定磷法、和定糖法（三）核酸含量的测定方法①磷的测定常用钼蓝比色法RNA中含磷量为9.0％，DNA中含磷量为9.2％，因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。②核糖和脱氧核糖的测定RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质，在670nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在595nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。③紫外吸收的测定实验室中最常用的首先测定样品在260nm和280nm的光吸收值（A值），从A260／A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA（或RNA）或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。二、核酸的超速离心不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。这一方法常用于质粒DNA的纯化。应用超速离心法，可以测定：核酸的沉降常素和相对分子量。（一）核酸密度的测定8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部）平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离（二）测定DNA的G-C含量G-C含量与其DNA的浮力密度之间呈正比关系ρ=0.100xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。（三）溶液中核酸构象的研究浮力密度：RNA＞DNA