葡萄糖酸的发酵生产.ppt

葡萄糖酸的发酵生产;葡萄糖酸的性质;

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;上海卡博工贸有限公司

山东新华医药集团

山东中舜科技发展有限公司;葡萄糖酸的发现;葡糖糖酸工艺的发展;1952年，Blom等发明了添加NaOH、维持pH6．5以上的方法生产葡萄糖酸钠，使糖的转化率达95％以上，发酵时间缩短至20小时以内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基础。

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;葡萄糖酸发酵的生物工艺;菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的生物合成的全过程，提高发酵产量。通过工艺优化，改进发酵培养基成份和发酵条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发酵产量

;高产菌株的筛选;葡萄糖氧化酶酶活力的测定

本研究采用分光光度计分析法测定葡萄糖氧化酶活性。反应混合液含2mL1mol/L葡萄糖（0.1mol/L的柠檬酸钠-磷酸缓冲液配制，PH=5.0)，1mL0.1％苯醌和100uL粗酶液，反应液于35℃下保温反应10min，于290nm处测定形成的氢醌的量。葡萄糖氧化酶的单位（U）定义为35℃PH=5.0下每克菌体每分钟产生1umol氢醌的酶量。;蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖氧化酶将培养基中的葡萄糖转化为葡萄糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I-离子还原为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反应形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种效率。;葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育

黑曲霉P-9经过紫外线照射处理，共获得8个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌株，分别是U-15、U-17、U-56、U-69、U-78。5个耐2-脱氧-D-葡萄糖突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株，产酶水平最高的是U-69菌株，为是28.7U/g出发菌株P-9倍，结果见表1。

;表1经过紫外线诱变所获得的突变菌株的葡萄糖氧化酶活性;

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;发酵过程影响葡萄糖酸产量的因素;葡萄糖酸浓度的测定

发酵过程中葡萄糖酸的生成会导致发酵液pH值下降,利用NaOH与葡萄糖酸中来维持发酵pH值时,生成葡萄糖酸的钠盐,其葡萄糖酸根可与Cu2+、Fe3+等金属离子发生络合反应,加热后呈现一定的色,660nm波长下可测定其吸收值,由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度。;

;葡萄糖含量的控制方式

葡萄糖在较高含量下,对许多微生物的生长和代谢都有抑制作用,使菌体生长速率和产物生成速率处于较低水平,发酵时间大大延长。

摇瓶实验

在葡萄糖含量分别为10%、20%和30%的发酵培养基中分别添加27g·L-1、54g·L-1、81g·L-1CaCO3,摇瓶发酵30h,考察葡萄糖含量对黑曲霉产酸的影响,结果见表2;表2葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响

;由表1可见,随着葡萄糖含量的增加,葡萄糖平均消耗速率加快,这说明高含量的葡萄糖对黑曲霉的生成和代谢没有抑制作用。从发酵糖酸转化率和葡萄糖酸平均生成速率上来看,糖含量为20%时最高。若采用30%葡萄糖摇瓶,培养基中葡萄糖浓度和CaCO3浓度太高,培养基粘度太大,严重阻碍了氧的溶解与传递,副产物生成量增加,导致转化率和葡萄糖酸平均生成速率下降。为此,可以采取初糖含量为20%、分批流加葡萄糖至30%和分批添加CaCO3至总量81g·L-1的方法来进行发酵工艺控制。;pH值的控制方式

黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中pH值会不断下降,若降至415以下会导致柠檬酸的生成,为此需对发酵过程中pH值进行控制,一般可通过添加碳酸盐、金属氧化物和碱来实行。在10L发酵罐(装液量615L,葡萄糖含量20%)中分别采用NaOH、Ca(OH)2、CaCO3来控制pH值,考察了不同控制方式对黑曲霉

发酵产酸的影响,结果见表3。;表310L发酵罐中pH值控制方式对发酵产葡萄糖酸的影响;由表2可见,发酵过程中流加NaOH控制pH值,各项指标都达最高,发酵时间最短;流加Ca(OH)2乳浊液和添加CaCO3控制pH值的指标接近,但比流加NaOH要低很多。当临近终点时,发酵液出现大量白色的葡萄糖酸钙结晶颗粒,使得发酵产物的浓度受到限制,无法得到高浓度葡萄糖酸。