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第160页,共172页，2024年2月25日，星期天第161页,共172页，2024年2月25日，星期天第162页,共172页，2024年2月25日，星期天第163页,共172页，2024年2月25日，星期天第164页,共172页，2024年2月25日，星期天第165页,共172页，2024年2月25日，星期天第166页,共172页，2024年2月25日，星期天第167页,共172页，2024年2月25日，星期天第168页,共172页，2024年2月25日，星期天第169页,共172页，2024年2月25日，星期天第170页,共172页，2024年2月25日，星期天第171页,共172页，2024年2月25日，星期天*感谢大家观看第172页,共172页，2024年2月25日，星期天**定义1：以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。定义2：将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。**原理

???????双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是：???????利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。?????????Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一个羟基（2′,3′-ddNTP）（图1），可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯键。因此，正在增长的DNA链不再延伸，使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样，在4组独立的酶反应体系中，在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后，链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争，在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。双脱氧链终止法测序原理如图2所示。??**M13噬菌体外形呈丝状，在颗粒内包装着单链环状DNA分子。因此其全名叫做M13单链DNA噬菌体。M13噬菌体只能感染具有F性须的大肠杆菌。F性须是大肠杆菌细胞壁上长出的一种特殊须状结构，具有F性须的细胞称为雄性细胞。感染时，M13噬菌体首先吸附在F性须上，然后其内的DNA顺着性须进入细胞内。一旦进入细胞内，M13单链DNA就立刻利用寄主细胞内的复制、转录和转译系统为自己“服务”。进入的M13DNA是裸露的单链环状DNA，能起模板的作用，称之为正（+）链DNA。以其合成的互补DNA链叫做负（-）链DNA。然后形成双链形式的复制型DNA，简称为RFDNA。RFDNA快速地被复制，使细胞内拷贝数猛增到一定程度。复制过程中，寄主细胞内慢慢积累了一种由M13单链DNA噬菌体编码的单链特异的DNA结合蛋白质，到了一定的程度后，就与RFDNA结合，使RFDNA的复制变成一种不对称的形式，单单只合成进入细胞时起模板作用的那条（+）链DNA链，而另一条互补（-）链DNA的合成就停止了。结果细胞内形成大量的（+）链DNA。M13DNA复制的同时还不“忘”表达，利用寄主细胞的“生产机器”合成出外壳蛋白。游离的（+）链DNA一旦接触到外壳蛋白，就立刻被“邀请”，包装进外壳蛋白内，形成噬菌体颗粒，成熟后就被挤压出寄主细胞。新的子代M13DNA噬菌体又会感染周围新的寄主大肠杆菌，重复以上的生命过程。第128页,共172页，2024年2月25日，星期天第129页,共172页，2024年2月25日，星期天第130页,共172页，2024年2月25日，星期天第131页,共172页，2024年2月25日，星期天第132页,共172页，2024年2月25日，星期天第133页,共172页，2024年2月25日，星期天第134页,共172页，2024年2月25日，星期天第135页,共172页，2024年2月25日，星期天第136页,共172页，2024年2月25日，星期天第137页,共172页，2024年2月25日，星