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4.精液冷冻保存的稀释液根据配制要求和稀释的需要，可将冷冻保存稀释液分别制成三种溶液。A基础液：将糖类、盐类，成批量的制成溶液，并密封保存。奶类经热处理。BI液：根据每次采精所需的冷冻稀释液的量，在基础液中加入一定量的卵黄和抗生素等配制成，用作第一次稀释。基础液+卵黄+抗生素。CII液：取需要量的I液，按照比例加入经灭菌的甘油，配制成含有甘油的II液，用作精液的第二次稀释。Ⅰ液+甘油。牛精液冷冻保存稀释液，主要有卵黄－柠檬酸钠－甘油液、卵黄－糖类－甘油、奶类－甘油液3种稀释液。第85页,共112页，2024年2月25日，星期天例：牛细管用冷冻稀释液基础液：2.9%的柠檬酸钠液。Ⅰ液：取基础液80mL，卵黄20mL，青霉素10万单位。Ⅱ液：含7%甘油的Ⅰ液。牛颗粒用冷冻稀释液基础液：蔗糖（乳）12g，蒸馏水加至100mL。Ⅰ液：基础液80mL+卵黄20mL+青霉素10万单位。Ⅱ液：含7%甘油的Ⅰ液。第86页,共112页，2024年2月25日，星期天稀释液成分与配比◆冷冻保存稀释液的成分※低温保存剂(卵黄、奶类)防冻保护剂(甘油)※维持渗透压物质(糖类、柠檬酸钠等)※抗菌素及其他添加剂◆牛精液冷冻保存稀释液●乳糖-卵黄-甘油(乳卵甘液)●蔗糖-卵黄-甘油(蔗卵甘液)●葡萄糖-卵黄-甘油(葡卵甘液)●葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄-甘油液(葡柠卵甘液)第87页,共112页，2024年2月25日，星期天国家标准规定：牛冷冻精液细管型容量为0.25ml,含直线前进运动的精子不低于1000万个；颗粒型精液容量为0.1ml，含直线前进运动精子数不低于1200万个。解冻后精子活力不低于0.3。0.25ml细管型冷冻精液稀释倍数应该为：X=直线前进运动精子数/ml×预测精子活力(≥0.3)×0.25ml/1000万精液冷冻前的稀释倍数第88页,共112页，2024年2月25日，星期天5.冷冻精液的制作技术（1）精液的稀释采用的冷冻精液剂型不同，所采用的稀释液的配方、稀释倍数和次数也不尽相同，一般多采用一次或二次稀释法。A一次稀释法：常用于颗粒精液，将含有甘油抗冻剂的稀释液按稀释比例一次同温稀释精液。B二次稀释法：常用于细管精液的冷冻，也适用于安瓿冷冻。将采出的精液在等温条件下，先用不含甘油的I液稀释至最终倍数的一半。稀释后的精液经1～1.5h缓慢降温至4～5℃。再用含有甘油的II液在等温条件下做等量的第二次稀释。第89页,共112页，2024年2月25日，星期天（2）精液平衡精液经含有甘油的稀释液（II液）稀释后，缓慢降温至4～5℃并放置一段时间，以增强精子的抗冻性，达到抗冻保护作用，这个处理过程称做平衡。平衡时间通常为2～4h为宜。（3）精液的冷冻A颗粒冷冻法：在装有液氮的广口保温容器上置一个铜纱网(或铝饭盒)，距液氮面1～3cm，预冷数分钟，使其温度维持在－80～－120℃，也可用聚四氟乙烯板（氟板）代替铜纱网，先在液氮中浸泡数分钟后，置于距液氮面2cm处，然后将经平衡的精液定量均匀而整齐的滴于其上，每粒0.1ml，停留2～4min后，当精液颜色变白时，将颗粒置于液氮中。取出1～2粒解冻，活率达到0.3以上者贮存于液氮灌中。第90页,共112页，2024年2月25日，星期天冷冻精液颗粒制作精液颗粒第91页,共112页，2024年2月25日，星期天B细管精液冷冻法：将细管放在距离液氮面上2～3cm的铜纱网上，停留5min左右，等精液冻结后，移入液氮中贮存。细管冷冻的自动化操作是使用控制液氮喷量的自动记温速冻器，5～－60℃每分钟降4℃，－60℃后尽快降到－196℃。（4）精液的解冻细管型、安瓿型冻精：直接将其投入到38～40℃的温水中，待冻精融化一半时，立即取出备用。颗粒型冻精：①干解冻：将冻精颗粒直接放入38℃～40℃的小试管中解冻，待溶化到1/2时取出在常温下完全解冻；②湿解冻：在预热的试管中加入解冻液（VB12等），待融化到1/2左右取出，在常温下完全解冻。第92页,共112页，2024年2月25日，星期天第93页,共112页，2024年2月25日，星期天6.精液冷冻保存的注意事项（1）冷冻精液的包装上须明确标明公畜品种、编号、生产日期、精子活率及数量，将冷冻精液分类装入液氮罐提筒内，浸入液氮贮存。（2）冷冻精液的保存原则是精液细管不能脱离液氮，因而必须定期向液氮灌内添加液氮，当液氮消耗掉1/2时应补充。冬季1次/月，夏季2～3次/月。（3）取细管精液时，动作要快，不可将精