几种重要的PCR应用技术.ppt

几种重要的PCR应用技术

几种重要的PCR技术

一、RT－PCR；二、5‘－RACE和3’－RACEPCR；三、差异显示PCR；四、出错PCR（致突变PCR）；五、OE－PCR。RT－PCR与反转录酶的故事

1970年，DNA依赖的RNA聚合酶的发现解决了一个长期困扰人们的迷惑：某些肿瘤病毒基因组是怎么复制成DNA，进而感染和抑制转化细胞的。反转录酶（RNA依赖的DNA聚合酶）这个名字起源于一个叫JohnTooze近乎玩笑的杜撰。他在一篇刊登在Nature上的无名消息与看法的专栏文章中首次应用了反转录酶这个名字，它使许多语言纯正癖的学者感到愤怒，而JohnTooze本人幸灾乐祸和处之泰然，反而使得反转录酶这个名字很快成为约定俗成的专业名词了。常见的三种反转录酶特性1、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与鼠白血病病毒勒尼株（Mo－MLV）来源的中温酶。AMV来源的反转录酶具有高活性的RNaseH,这种高活性RNaseH趋向于抑制cDNA的产生限制其合成长度。Mo－MLV来源的反转录酶更适合RT－PCR，因为它的RNaseH活性较弱。但它催化反应的最适温度为37度，较AMV反转录酶的42度为低，因而对于具有高度二级结构的RNA模板可能会带来稍微不利的影响。2、缺乏RNaseH活性的Mo－MLV反转录酶的突变体。这些酶较野生型酶对模板RNA分子的转录效率更高，合成cDNA分子的长度更长。此外，还能在更高温度下合成cDNA（高达50度），这对于容易折叠成二级结构的RNA模板更为有利。3、嗜热热稳定TthDNA聚合酶，这种酶在RT－PCR中的主要优点：它能在反转录与扩增两个阶段均起作用，实验在同一个反应管内进行。但这种酶功不抵过，一方面这种酶合成的cDNA平均长度仅为1－2kb,它短于Mo－MLV反转录合成的cDNA长度（约10kb）；此外，Mn2＋的存在会造成DNA合成的低保真度也是令人担心的地方。最后，该酶不能用Oligo(dT)或随机六核苷酸作为引物，因为它的催化反应的最适温度下这两种引物不能与RNA模板形成稳定的杂合体。RT－PCR的用途

（Reversetranscriptase-PCR）反转录PCR是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT－PCR对于获得克隆mRNA的5‘、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏和通用的方法。此外，RT－PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性；还可用于测定基因表达的强度，尤其是在可获得mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时即可用RT－PCR方法分析。RT－PCR的原理首要步骤为酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对单链cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计特殊的引物与之杂交，或可用随机引物与所有mRNA杂交等。上述原理图的解释和讨论（1）Oligo(dT)能与哺乳动物mRNA的内源poly(A)+相结合，作为一条通用引物能用于常规的第一链cDNA的合成。后续PCR扩增可用一条或多条基因特异性引物与oligo(dT)配对来产生一种特异性的mRNA3’末端序列的拷贝。cDNA合成能用一种合成的反义寡核苷酸引物来引导，该引物可选择与特殊靶RNA或mRNA的家族序列的某个区域相杂交。期望的特异的cDNA片段能通过PCR扩增来获得，比如，正义和反义寡核苷酸引物可选择特殊的cDNA的特殊序列来设计。为了达到最大的特异性，反义引物应该设置在用于引物cDNA合成的寡核苷酸的上游。寡核苷酸引物设计尽可能根据靶RNA的不同外显子的序列结构来设置结合位点，并应用正义与反义引物来扩增cDNA产物。用这种方法，从cDNA和污染的基因组DNA衍生的扩增产物极易鉴别。然而，用内含子很少的基因的转录本作模板不易鉴别从污染的基因组DNA衍生的扩增产物。在这种情况下，RNA样品最好用没有RNase的DNase来处理。应用随机六核苷酸引物是能够沿着RNA模板的许多位点引导cDNA合成，并产生RNA分子总体中的许多片断的拷贝。尤其在靶RNA序列很长或包含很多二级结构使之用oligo(dT)或合成的寡核苷酸引物不能有效引导cDNA合成时，应用随机六核苷酸引物是非常有用的。因为所有种群的mRNA都能够作为PCR模板，再结合针对特异性cDNA序列设计的正义和反义引物进行PCR扩增，可得到基因特异性的扩增产物。上述原理图的解释和讨论（2）在许多情况下，研究者的目的在于产生的第一链cDNA应该尽可能的长，并且