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实验33 过氧化氢酶的活性测定

目的意义

过氧化氢酶（catalase，CAT）普遍存在于植物所有的组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系，故常加以测定。

本实验的目的在于掌握过氧化氢酶活性测定的方法、原理及操作技术。

一、高锰酸钾滴定法

（一）原理

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂，因此，可根据HO的消耗量

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或O的生成量测定该酶活力大小。

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在反应系统中加入一定量（反应过量）的HO

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溶液，经酶促反应后，用标准KMnO溶液

4

（在酸性条件下）滴定多余的HO，即可求出消耗的HO的量。

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5HO +2KMn0 +4HSO ──→50 +2KHS0 +8H0+2MnS0

22 4 2 4 2 4 2 4

（二）实验材料、仪器与试剂

实验材料：小麦叶片。

仪器：恒温水浴、研钵、三角瓶、酸式滴定管、容量瓶等。

试剂：

（1）10％HSO

2 4

（2）0.2mol·L-1

（3）0.lmol·L-1

pH7.8磷酸缓冲液

KMnO标准液：称取KMnO（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制

4 4

成1000mL，再用0.lmol·L-1草酸溶液标定。

（4）0.lmol·L-1

HO：市售30％HO大约等于17.6mol·L-1，取30％HO溶液

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5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.lmol·L-1

KMnO溶液（在酸性条件下）进行标定。

4

（5）0.lmol·L-1草酸：称取优级纯HCO·2HO12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至

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1000mL。

（三）操作步骤

酶液提取：称取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容至刻度，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

酶活测定：取50mL三角瓶4个（2个测定，2个对照），测定瓶加入酶液2.5mL，

对照瓶加煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL0.lmol·L-1

HO，同时计时，于30℃恒温水浴中

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保温10min，立即加入10％HSO 2.5mL。用0.lmol·L-1

2 4

红色（在30min内不消失）为终点。

（四）结果计算

KMnO标准溶液滴定，至出现粉

4

过氧化氢酶活性单位（U）定义为1g鲜样1min分解1mgHO所需的酶量。

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? ? V

A?B

T

V

?1.7

过氧化氢酶活性?

S

W?t

式中：A为对照KMnO

4

滴定值（mL）；B为酶反应后KMnO

4

滴定值（mL）；VT

为提取酶

液总量（mL）；V

S

为反应时所用酶液量（mL）；1.7为1mL0.1mol·L-1

KMnO

4

相当于1.7mg

HO；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）。

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【附注】

所用KMnO溶液及HO溶液临用前要经过重新标定。

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二、紫外吸收法

（一）原理

HO在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解HO，使反应溶液吸光度（A ）随

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反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

（二）实验材料、仪器与试剂

实验材料：小麦叶片或其他植物组织。

仪器：紫外分光光度计、离心机、水浴锅、研钵、容量瓶、移液管、试管等。

试剂：

（1）0.2mol·L-1pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）

（2）0.1mol·L-1HO（用0.1mol·L-1KmnO

标定）

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（三）操作步骤

酶液提取：称取新鲜小麦叶片0.5g，置研钵中，加入2～3mL4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度。混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

测定：取3支试管，其中2支为样品测定管（取平均值），1支为空白管（加煮死

酶液），按下表添加试剂。25℃预热后，逐管加入0.3mL0.1mol·L-1

HO，每加完1管立

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即计时，并迅速倒入石英比色杯中，2