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生物样品预处理

生物样品预处理

预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15mol/LKCl溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。

将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1mol/LTris-HCl,pH7.4,0.15mol/LKCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/LEDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。

分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。

（1）250mL0.15mol/LKCl：取2.7956g

（2）Tris-HCl缓冲液：125mL0.1mol/LTri（sKCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）

1.5143g）+105mL0.1mol/LHCl+

（

（Na+＋K+）－ATPase活性的测定

1、试剂

（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g

+5mmol/LEDTA0.3653g

（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑1.3616g+4mmol/LMgCl20.2033g+40mmol/LKCl0.7455g

（3）16mmol/LNa2ATP（10ml）：0.0988g

（4）30%三氯乙酸（TCA）9gTCA+21mlH2O

（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml5mol/LH2SO4+1.3556g钼酸铵+90mlH2O

每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2

O0.2353g，临用前配制。5mol/LH2SO4：2.7mlH2SO4+7.3mlH2O

（6）1mmol/L乌本苷（100ml）：0.0767g

（7）50μg/mL磷标准溶液（1000ml）：0.2195gKH2PO4

2、无机磷标准曲线的绘制：各试管分别加磷标准溶液0、0.20、0.40、0.60、

0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0m1，混匀后各吸取0.

08ml加入酶标板，同时加入0.08mlTCA，0.08ml定磷试剂，混匀后650nm处比色测吸光值。

3、酶活性测定

ATPase制剂：匀浆比（W/V）为1:40，离心10min（9000r/min）取上清液得到。

总酶活：酶液10μ1+反应缓冲液40μl+H2O20μ1+Na2ATP10μ1（空白用H2O代替Na2ATP，空白仍需加入酶液）。25℃保温15min后加入冷的30%TCA80μ1终止反应+定磷试剂80μ1，静置5min后读数。

Mg2+-ATP酶活：酶液10μ1+反应缓冲液40μl+H2O10μ1+乌本苷10μ1+Na2ATP10μ1，其余同总酶活性测定。

4、蛋白质含量测定

1:40匀浆后1:5稀释测蛋白。

5、计算

10μl蛋白质含量：X*5*10μg

Pi浓度计算：有标准曲线得Yμg/ml

10μl酶液的量：m=X*0.08ml

Pi的物质的量：n=m/M=m*103/31nmol

ATP活性：n*4/蛋白质含量=X*0.08*103*4/31μmol/mgpro/h

SOD

SOD酶活性测定

1、试剂

（1）Tris-HCl缓冲液

0.1mol/l的盐酸：取浓盐酸（密度为1.18，36%）8.4ml，加双蒸水稀释至

1000ml。

mol/l的Tris溶液：取6.057克Tris，加水溶解，配成500ml。Tris-HCl缓冲液（pH为8.4，浓度0.1mol/l）：取86ml0.1mol/l盐酸，取250ml0.1mol/l的Tris溶液，加双蒸水稀释至500ml。

（2）10mmol/lHCl：取0.1mol/l的盐酸10ml,加双蒸水稀释至100ml。

（3）6mmol/l邻苯三酚(精确)：用10mmol/lHCl配制。0.07567g+100ml10mmol/lHCl。

2、邻苯三酚自氧化速率的测定

邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300μLTris-HCl缓冲液，放置酶标仪中25℃恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10μ