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对ELISA方法检测HBSAg结果的分析

当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将

抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相

抗体上，洗涤除去未结合的抗原。2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗

涤除去未结合的游离未结合物。3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶

催化底物反应生成有色产物。在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的

抗原有关。该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。血

清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，

嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，

这不是人为因素造成的。在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求检验报告，较难逐

个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不

当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。本文对检验工作中经常现的如

标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。

1.标本溶血

由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附

于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显

色，现假阳性。有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1。要认真做好标本的保存

和处理工作，防止溶血。

2.标本受到污染

标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，现

假阳性。

3.标本放置时间

在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定

中会导致本底过深，甚至造成假阳性。采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要

储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。

4.标本凝固不完全

在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液自然存在放1-2h后，再用3000pm离心15

分钟。临床检验工作中，常常因争取时间快速检测，在血清还未凝固完全时即强行离心分离

血清，血清中残留的部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可形成肉眼可见的纤维蛋白块，

易造成假阳性，次日复查时因血已凝固完全，血清中不在含有纤维蛋白原，结果显示为阴性。

5.血清标本中HBSAg含量的影响

目前国内用于检测HBSAg的ELISA是双抗体夹心一步法，检测HBSAg时，HBSAg标本中浓度

有一定范围。标本中HBSAg浓度过高，回应钩状效应(LK)现象现假阴性[2,3。而在二步

法中，高浓度的HBSAg与包被的HBSAg“饱和”地结合，多余部分被洗掉，随后加入的酶结合

的HBSAb正好通过HBSAg的“桥梁”作用结合在酶标板上，显示阳性结果。另外不单项检测

HBSAg，而是检测乙肝五项指标或检测HBSAg两项，可以解决因高浓度的HBSAg而现的假

阴性[4。低浓度样本(HBsAg浓度介于0.5-5ug/ml)的血清标本，ELISA显色较弱，同样会导致

假阴性，对于HBSAg浓度大于5ug/ml的血标本，ELISA检测HBSAg约有1.58%的假阴性，血

清HBSAg浓度在5ug/ml以下的弱阳性约有2.92%的假阳性率[5。若结合MEIA（微粒子酶免

疫试验）及其中和确认试验进行检测，能有效提高低浓度HBSAg的检率[6。

6.ELISA检测方法的灵敏度是有限的

现国产第三代ELISAHbsAg试剂盒检测HbsAg的窗口期为72d，即使目前的最高试剂的窗口

期HbsAg也为50d[7，因此处于窗口期的血液检测当前结果为阴性，下次检测结果可能为阳

性。手工操作影响的因素很多，标本量大加样后放入孵育箱前等待时间过长（尤其是室内温

度比较高）；放入孵育箱孵育时未贴封片或加盖，造成标本和稀释液蒸发，吸附在孔壁，导

致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以彻底清洗，使结果造成假阳性。加样后马上贴胶纸

片混均振荡放入孵育箱；标本过多时可分批操作；严格按照说明书控制操作时间。在实际工

作中，要认真做好样本的保存和处理工作，以减少外源性因素的影响，保证检验结果可靠。

参考文献

[1詹彤，高美霞，薛敏，等.溶血样本对乙肝表面抗原检测的影响