细胞培养基本常识.docxVIP

细胞培养瓶容量,一般以1x105cells/cm2计算

一.培养基

液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。

液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

粉末培养基配制(以1升为例)：

细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为

7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

二.基础培养基

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`sMEM的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`sF12也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的 CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`sL15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

三.无血清培养基

1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不

需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的组合置换培养基中的成分，最后找到了适合大多数细胞培养的试剂配方，该配方称为N2，专门用于神经细胞培养，最早是用在B104大鼠神经母细胞瘤细胞系的培养。它的基础培养基是1：1的DMEM与H12的混合液，添加了胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、腐胺和硒。胰岛素和胰岛素样生长因子对于大多数类型细胞的存活和生长有重要作用，硒是谷胱甘肽产生的合作因子，可能有助于过氧化物和超氧化物的水解，有报道说还能防止细胞的光照损伤。随后的其他配方如N1N3则含有较低浓度的转铁蛋白。

未料到的是上述配方构成的培养基可以支持神经母细胞瘤细胞系快速增殖，随后又发展了能支持原代培养的各种神经元生长的培养基，这种培养基在许多实验室里已取代了有血清培养。在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，这样的培养基可以消除来自血清的不均一性。更为重要的是，它们可用来检测生长因子以及其他促进神经元存活或生长的因子，或者用来检测那些可保护神经元免遭环境毒物损伤的制剂。专用于神经元的培养基在某些培养环境中还可以减低非神经元细胞的增殖，故可使神经元纯化。

血清中含有的组分，例如血清蛋白，可作为代谢毒物清除剂使用并能聚集于培养基中。当缺

乏这些成分时，如神经元在无血清培养基中生长时，特别容易为过氧化物及自由基伤害，这已被许多研究者注意到了。过氧化物酶以及超氧化物歧