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细胞培养

动物细胞培养工作的基本要求

1、培养前准备：做好实验计划和操作程序，准备好所需器材和物品。

2、操作间消毒：紫外线照射30min，实验结束后75%酒精擦拭工作台。

3、洗手和着装：穿拖鞋、无菌衣、带帽子、口罩、洗手后带手套。

4、火焰消毒：首先点燃酒精灯，一切操作均需在火焰近处并经过烧灼进行。

注意：

⑴金属器械灼烧的时间不可太长，以防退火。

⑵吸过培养基的吸管不能再用火焰灼烧。

⑶开启、关闭长有细胞的培养瓶时，灼烧时间要短。

⑷胶塞过火焰不可时间长。

5、实验中的操作要求：

①合理布局：酒精灯置于中央，左手物品放于左侧，右手物品放于右侧。

②动作准确敏捷，但不必太快，以防空气流动。

③细胞未做处理前勿过早暴露于空气中。

④培养液在未用前勿过早开瓶。

⑤试剂用过之后如不再重复使用，立即封闭瓶口。

⑥工作中不能面向操作间讲话或咳嗽。

动物细胞培养常用术语

细胞凋亡（apoptosis）

细胞融合（cellfusion）

细胞系(cellline)：原代培养物培养成功后即为细胞系。

细胞株(cellstrain)：具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。

克隆(clone)：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群，它们的遗传特性相同。

汇合(confluence)：所培养的细胞彼此汇合形成单层。

传代(passage;subcluturre)：将细胞从一个培养瓶转移至另一个培养瓶的过程。

转染(transfection)：用生物学、化学或物理学的方法将某个基因转移至培养细胞内的一种手段。

细胞培养基及常用液

㈠培养基的基本要求

营养成分

⑴氨基酸：12种L型必需氨基酸、谷氨酰胺

⑵单糖：六碳糖。主要为葡萄糖

⑶维生素：作为细胞代谢中的辅酶、辅基

⑷无机离子与微量元素：细胞生长需要

促生长因子及激素

渗透压：260—320mOsm/kg

4.pH:7.2—7.4

5.无毒、无污染

㈡培养基的类型

天然培养基：血清、血浆、胚胎浸出液

合成培养基：模仿动物体内生长所需成分，人工模拟合成的、配方恒定的培养基。

㈢几种常用培养基

DMEM（Delbecco’smodifiedEaglemedium）

⑴分为高糖型（含葡萄糖4500g/l）低糖型（含葡萄糖1000g/l）

⑵高糖型有利于细胞停泊于一个位置，适合贴壁较困难的细胞。

RPMI1640

适合于多种细胞生长，为使用最广泛的培养基之一。

HamF12

⑴可在加入血清较少的情况下使用，适合于进行单细胞分离培养。

⑵是无血清培养基中常用的基础培养基。

IMDM

⑴改良的DMEM，增加了aa、维生素、HEPES。

⑵适合于细胞密度低、细胞生长困难的情况。

㈣其他培养用液

平衡盐溶液

⑴构成：无机盐、葡萄糖

⑵作用：维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定

⑶常用:BSS、PBS、Hanks、D-Hanks液

⑷消毒方法：过滤除菌、高温高压灭菌

消化液

⑴消化酶溶液：

用不含Ca2+；Mg2+及血清的BSS配置，过滤除菌，破坏细胞同蛋白质及细胞连接

⑵胶原酶溶液：

浓度0.2mg/L，常用于上皮类细胞培养，作用对象为胶原组织，对细胞不产生伤害。3.pH调整液

NaHCO3溶液：5.6%或7.4%浓度HEPES液：防止培养基pH值迅速变动4.抗生素液

双抗：青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml5.谷氨酰胺补充液

终浓度0.002mol/L，使用前添加。多配置成100倍浓缩液，过滤除菌后，分装冻存。

第二讲培养细胞的细胞生物学

一、培养细胞的生长类型和形态特征

1、贴壁型细胞:指必须贴附在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

⑴成纤维细胞型：凡在细胞培养中形态与成纤维细胞类似的细胞。

来源：由中胚层间充质组织起源的组织，如：真正的成纤维细胞、心肌纤维、平滑肌纤维、成骨细胞、血管内皮细胞等。

生长特点：排列成放射状、旋涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动；游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。

形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形；胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核。

⑵上皮细胞型

来源：内胚层和外胚层细胞，如：皮肤及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性肿瘤等。

生长特点：易连成片，成铺路石状；生长时成膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

形态：类似于体内的上皮细胞，扁平、不规则多边形，内有圆形的细胞核。

⑶游走细胞型：有类似巨噬细胞样的特征。

来源：具有吞噬功能的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。

生长特点：在支持物上散在生长，一般不连接成片，形成群落；在培养器皿壁上生长位

置不固定，呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向