基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术.pptVIP

精品课件CRISPR/Cas的基因座结构相对简单。以产脓链球菌(StreptococcuspyogenesSF370)的典型TypeⅡCRISPR/Cas为例，其基因座结构可分别三部分，5’端为tracrRNA基因，中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3’端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats)顺序排列组成。3.TypeⅡCRISPR/Cas系统的结构及作用机理精品课件crRNAs：CRISPR位点的第一个重复序列上游有CRISPR前导序列(Leadersequence),该前导序列可以作为启动子,启动CRISPR序列的转录。多个研究表明CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA)，然后在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元，这些小RNA即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成，被命名为CRISPRRNAs(crRNAs),这些crRNA和Cas蛋白共同参与CRISPR免疫防御过程。精品课件tracrRNA：他们发现tracrRNA(trans-activatingcrRNA)对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5’端与成熟的crRNA3’端有部分序列(约13bp)能够配对进而形成茎环结构，对维持crRNA与靶点的配对可能十分重要。其指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟，随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。根据tracrRNA与crRNA的结构特性，他们将tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA(guideRNA，gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能，在目的基因处切割,形成DSBs,该过程是CRISPR/Cas对基因组进行编辑的基础。精品课件精品课件Cas9：体外实验证明Cas9基因是参与CRISPR免疫系统的唯一必需基因,Cas9是由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白,含有2个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like结构域及位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域,HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链,切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospaceradjacentmotif,PAM)上游3nt处,RuvC-like结构域可以对另一条链进行切割,切割位点位于PAM上游3~8nt处。在crRNA与tracrRNA形成的双链RNA的指导下,Cas9蛋白对靶位点进行切割。此外，他们还证明，将RuvC或是HNH活性突变后Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶。精品课件到目前为止,虽然CRISPR/Cas系统的详细作用机制尚未完全阐明,但已基本明确了该作用机制的整个过程,该过程大体分为3个阶段：1.在噬菌体入侵的起始阶段,Cas蛋白复合物靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列(protospacer),protospacer接下来整合到宿主基因组的CRISPR位点的5′端;2.然后这些短的掺入的protospacer被转录成crRNA;3.最后阶段是在Cas蛋白复合物的参与下,靶向和干扰侵入的噬菌体DNA序列。当同种噬菌体再次入侵时,CRISPR的repeats序列截取和保留的入侵噬菌体的某些DNA片段形成spacers,spacers会转录形成一些小的crRNA,这些crRNA会与trans-activatingcrRNA(tracrRNA)形成一种双链二级结构,以此招募Cas蛋白,crRNA、tracrRNA以及Cas蛋白形成复合体,识别紧随protospacer序列后的PAM序列,Cas蛋白的核酸酶结构域对与crRNA互补的双链DNA进行切割,从而使细菌具有对抗同类噬菌体再次入侵的能力。CRISPR基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低，当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时CRISPR的表达很快被诱导上调。精品课件精品课件TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对TALEN基因敲除X2TALEN表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。